利用超微粉碎提高花色苷生物可接受率

張佩雯，黃光捷，駱昌錦，冼瑩瑩，周欣燕，郭紅輝，*

（1.廣東醫科大學公共衛生學院，廣東 東莞 523808；2.韶關學院英東食品學院，廣東 韶關 512005）

花色苷是具有2-苯基苯并吡喃結構的一類植物化學物，對可見光的最大吸收波長在460 nm～540 nm處，可以使植物呈現紅色、紫色乃至黑色。深色植物性食品中的花色苷含量較為豐富，例如漿果（越橘、藍莓、草莓、葡萄和黑醋栗等）、蔬菜（紫甘藍、紫洋蔥和紅菜薹等）、薯類（紫馬鈴薯和紫番薯）和谷物（高粱、紫玉米和黑米等），花色苷含量通常介于50 mg/kg～3 100 mg/kg（以鮮重計），平衡膳食者每天通過這些食物可以攝入數十毫克的花色苷[1-2]。除了賦予植物性食品鮮艷的色澤，近年來的流行病學研究發現增加膳食花色苷攝入有助于降低非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病及心血管疾病等慢性代謝性疾病的發病風險[3-4]。根據已有對慢性病人群的隨機對照臨床干預試驗結果，中國營養學會提出花色苷預防慢性病的攝入量特定建議值為50.0 mg/d[5]。然而，由于食物破碎程度和基質成分的影響，不同食物來源花色苷的生物利用度和生物活性差異較大，攝入量和健康效應之間的量效關系尚不明確，無法制定準確的攝入量參考值范圍[6]。

花色苷的化學結構含有多個酚羥基，極性較強，容易與蛋白質、膳食纖維等食物基質成分結合在一起，加上細胞壁對消化酶的物理阻隔效應，在消化過程中難以釋放出來，無法被吸收利用[7-8]。準確判定膳食花色苷經過胃腸消化后可被機體利用的程度，即花色苷的生物可接受率或生物利用度，是建立攝入量和健康效應關系的前提條件。體內試驗往往存在研究周期長、個體間的差異、結果重現性差、費用高、倫理限制等問題，而近些年不斷完善的體外模擬胃腸消化模型為研究多酚類植物化學物的生物利用提供了便利條件[9]。模擬體外消化模型分為胃消化和腸消化兩個階段。基于國際多領域專家共識的INFOGEST建立了一套更加接近人體生理環境的體外口腔-胃-小腸模擬消化吸收模型，對不同食物當中的營養素進行了體外模擬消化吸收研究，提出可以用消化液當中營養物質的釋放量與總攝入量的比值表示其生物可接受率，模擬某種營養物質在機體的消化吸收利用情況[10]。

因此，本研究選擇藍莓、紫甘藍、紫番薯和黑米分別作為漿果、蔬菜、薯類和谷物的代表性食物，通過超微粉碎和消化酶破除細胞壁和食物基質對花色苷的束縛作用，利用體外胃腸消化模型研究花色苷生物可接受率的變化，為準確評估食物花色苷可被機體利用的程度提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

“兔眼”藍莓：安慶市茂祥農業科技發展有限公司；紫甘藍、“廣紫薯八號”紫番薯、黑米：韶關市農貿市場。胃蛋白酶（≥250 U/mg）：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；豬膽鹽和豬胰酶復合物（蛋白酶≥100 U/mg，淀粉酶≥100 U/mg，脂肪酶≥8 U/mg）：廣州鼎國生物技術有限公司；C18色譜柱（粒徑5μm，250mm×4.6mm）、甲醇、甲酸色譜純：北京迪馬歐泰科技發展中心；其它化學試劑為市售分析純。

1.2 主要儀器設備

DHG-9420A電熱恒溫鼓風干燥箱、DZF-6050真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；DLF18中藥粉碎機：溫州頂歷醫療器械有限公司；YF2-2氣流式超微粉碎機：瑞安永歷制藥機械有限公司；SHA-B恒溫振蕩水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；TM3030電子顯微鏡：日立高新技術公司；LS-POP激光粒度儀：珠海歐美克儀器有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀：島津企業管理（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物材料粉碎

60℃條件下，利用鼓風干燥箱和真空干燥箱將藍莓、紫甘藍、紫番薯和黑米干燥至含水量≤10%。植物材料投料進入中藥粉碎機中進行機械粉碎，得到粗粉；利用氣流式超微粉碎機將植物材料粗粉在轉速20 000 r/min條件下粉碎兩次，每次3 min，得到超微粉。將制備好的粉末用鋁箔袋密封，置于-18℃冰箱中保藏待用。

1.3.2 粒度測定

準確稱取粗粉和超微粉樣粉各1.00 g，溶于80 mL蒸餾水中，用磁力攪拌器攪拌10 min至均勻，使用激光粒度分析儀測定樣品粒徑，采用公式計算離散度表示樣品粒徑的分布情況。

式中：Dn代表有n%的顆粒粒徑小于該數值[11]。

1.3.3 顯微形貌

將粗粉與超微粉分別均勻粘附在導電膠帶上，置于載物臺，選擇5個視野拍照。

1.3.4 主要營養成分和花色苷含量測定

參照現行食品安全國家標準[12]分別測定脂肪（GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》）、蛋白質（GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》）、總膳食纖維（GB 5009.88—2014《食品安全國家標準食品中膳食纖維的測定》）、水分（GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》）和灰分（GB 5009.4—2010《食品安全國家標準食品中灰分的測定》）的含量，計算出碳水化合物含量（GB/Z 21922—2008《食品營養成分基本術語》）[12]。

準確稱量1.00 g粉體，投入10 mL甲醇，密封后在37℃的恒溫水浴搖床中60 r/min振蕩提取2 h，0.45 μm微孔濾膜過濾，用分光光度計在520 nm處測定濾液吸光度，采用公式計算粉體花色苷含量[8]。

式中：X為粉體花色苷含量，mg/g；ΔT為pH1.0和pH4.5緩沖液稀釋待測液后的吸光度差值；V為稀釋體積，L；F為稀釋倍數；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量（M=449.2）；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數[ε=26 900 L/（mol·cm）]；m為樣品質量，g。

1.3.5 模擬消化

取植物材料粗粉和超微粉各1.00 g置于離心管中，加入人工胃液15 mL（表1）[10]，用1 mol/L鹽酸調節溶液pH值為2.0，置于振蕩速率為40 r/min，37℃的恒溫水浴搖床中避光振蕩2h，完成模擬胃消化；加入25mL人工腸液，用飽和NaHCO3溶液調節pH值為6.8，置于振蕩速率為60 r/min，37℃恒溫水浴搖床避光振蕩4 h，完成模擬小腸消化；收集消化液，0.45 μm微孔濾膜過濾，在高效液相色譜儀檢測濾液花色苷含量，以同體積甲醇代替人工胃液和腸液，作為花色苷最大釋放量參照[13]。

表1 人工消化液組成Table 1 Composition of simulated digestion fluids

1.3.6 花色苷生物可接受率

高效液相色譜儀進樣量為20 μL，洗脫速度設置為1.0 mL/min，流動相A為甲醇，流動相B為2%甲酸水溶液，檢測波長為520 nm，梯度洗脫：0～5 min，90%B；5 min～35 min，90%～60%B；35 min～55 min，60%～40%B；55 min～60 min，40%～0%B；60 min～70 min，90%B。

對各個樣品消化液花色苷峰面積進行自動積分求和，以甲醇提取樣品的花色苷峰面積總和設定為100%，采用公式計算花色苷生物可接受率[13]。

1.3.7 數據處理

使用SPSS 19.0軟件對數據進行處理，結果用3次重復試驗數據±S表示，對粗粉與超微粉的理化參數運用獨立樣本t檢驗的方法進行分析，對花色苷生物可接受率采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較差異，檢驗水準設為p＜0.05。

2 結果與討論

2.1 超微粉碎對食物樣品粒徑分布的影響

食物樣品粗粉和超微粉粒徑分布見表2。

表2 食物樣品粗粉和超微粉粒徑分布Table 2 Particle size distribution of coarse and superfine food powders

植物細胞的直徑通常為30 μm～100 μm，一般機械粉碎得到的粉體直徑約為150 μm～300 μm，很難將細胞壁破碎[14]。經過超微粉碎，4種食物樣品的粒徑D10、D50和D90均顯著低于粗粉（表2），其中D50符合超微粉的粒徑判斷標準（≤25 μm），從而達到了破除細胞壁的預期效果[15]。紫甘藍、黑米和紫番薯3種食物樣品超微粉離散度均顯著小于粗粉，說明其粒徑分布更加均勻；然而，超微粉碎并未使藍莓果粉離散度顯著降低，可能與漿果中果膠質含量較高，粉體不易分散有關[16]。

2.2 不同粉體的顯微形貌

4種樣品粗粉和超微粉放大400倍的顯微形貌如圖1所示。

由圖1可知，粗粉顆粒明顯大于超微粉，紫甘藍、黑米和紫番薯3種離散度較大的粗粉粒徑大小更為不均勻，形狀也不規則；與其他學者的研究結果相似[14-15]，經過超微粉碎，食物樣品的絕大部分纖維束冠狀結構被破碎，質地更加蓬松，粉體顆粒大小均勻，直徑較小，顆粒形貌趨于一致。

圖1 各種食物粉體顯微形貌Fig.1 The micromorphology of various food powders

2.3 超微粉碎對食物樣品主要營養成分的影響

食物破碎程度會直接影響到消化酶與食物顆粒的接觸，從而決定營養素的消化吸收率[17]。為明確粉碎程度對宏量營養素釋放的影響，利用國家標準食品理化檢驗方法對4種食物樣品的營養成分組成做了分析，結果見表3。

表3 4種食物樣品粗粉和超微粉的營養成分組成Table 3 Nutrient composition of coarse and superfine powders of four food samples

表3結果表明，粉碎程度對食物脂肪、蛋白質、碳水化合物、總膳食纖維和灰分含量檢測值并沒有造成顯著影響。經過超微粉碎后，由于破除了細胞壁和部分食物基質對花色苷釋放的阻隔作用，4種食物樣品的花色苷含量檢測值均有顯著提高，其中藍莓和紫甘藍的檢測值增加幅度統計學差異極顯著（p<0.01）。

2.4 超微粉碎和纖維素酶對食物樣品花色苷生物可接受率的影響

花色苷的生物活性大小取決于其被機體吸收和利用程度，現有動物整體生物利用度試驗和人群代謝動力學試驗研究結果顯示，不同食物來源花色苷的生物利用度差異較大，介于0.8%～12.4%之間[18]，生物利用度從大到小順序為：花色苷單體、花色苷提取物、澄清果汁和固態食物[19]?；ㄉ赵谥参锛毎麅瓤梢酝ㄟ^共價鍵、氫鍵和親水作用力與碳水化合物和蛋白質等基質成分結合，在胃消化階段，胃液的強酸性可以將部分花色苷從食物基質解離出來，通常不同食物花色苷的釋放量差別不大，而在腸消化階段，pH值偏堿性，花色苷的化學結構由黃烊鹽陽離子轉變為查爾酮或者甲醇式假堿，與食物基質結合更加緊密，就需要蛋白酶和淀粉酶酶解將花色苷從食物基質釋放[20]。超微粉碎和纖維素酶對食物樣品花色苷生物可接受率的影響結果見圖2。

圖2 4種食物樣品粗粉和超微粉的花色苷生物可接受率Fig.2 Anthocyanin bioaccessibility of coarse and superfine powders of four food samples

圖2結果顯示，藍莓、黑米和紫番薯粗粉花色苷的生物可接受率均超過60%，而紫甘藍粗粉的生物可接受率最低，僅為46.5%。細胞壁的物理阻隔和食物基質結合效應可能是影響花色苷在腸道被吸收利用的主要因素[21]。進一步對超微粉花色苷生物可接受率的檢測結果表明，藍莓、紫甘藍、黑米和紫番薯超微粉花色苷峰面積均顯著大于粗粉（p＜0.05），計算得到的花色苷生物可接受率較粗粉分別提高37.1%、87.7%、24.7%和23.8%，說明超微粉碎可以有效提高花色苷的生物可接受率。與pH示差法檢測花色苷總量結果相似（表3），藍莓和紫甘藍不同粉體花色苷的生物可接受率差異極顯著，可能與粉體較高膳食纖維含量有關。

3 結論

綜上所述，超微粉碎可以有效破除細胞壁和食物基質對藍莓、紫甘藍、黑米和紫番薯中花色苷的阻隔效應，將花色苷的生物可接受率提高23.8%～87.7%。在利用纖維素含量較高的植物材料制備花色苷提取物或者固體飲料等富含花色苷的食品時，通過超微粉碎輔助處理原料將有助于提高花色苷的提取效率或者機體對花色苷的吸收利用程度。