黑曲霉固態發酵涼茶渣產酶工藝研究

袁明貴，向蓉，馬廣宇，彭新宇，田雅，周廷斤，徐志宏，3*，祁振寬

（1.廣東省農業科學院動物衛生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣東省中獸藥工程技術研究中心，廣東 廣州 510640；2.河南牧業經濟學院動物醫學院，河南 鄭州 450046；3.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室肇慶分中心，廣東 肇慶 526238；4.清遠加多寶草本植物科技有限公司，廣東 清遠 511675）

中國主流的飲用性涼茶是由雞蛋花、金銀花、菊花、涼粉草、夏枯草、甘草和布渣葉共7種植物藥物煎制而成。近年來，隨著涼茶產業的快速發展，涼茶渣的排放在逐年增加，日產量達到680 t[1]。目前國內對涼茶渣的資源化利用研究比較缺乏，僅在直接作為飼料添加劑或生物質能源方面有少量的報道[1-2]，大量的涼茶渣依然采用直接堆放、填埋或焚燒等方式處理，造成了嚴重的資源浪費和環境污染。

植物細胞壁主要由纖維素、木聚糖和果膠組成，共同保護細胞免受傷害，同時也阻礙了動物對營養的消化利用。纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶可以將對應的大分子底物降解成單糖或寡糖，消除抗營養因子，促進細胞內營養和活性物質的釋放[3]，為動物提供易于消化吸收的糖類化合物[4]，因此，纖維素酶[5-6]、果膠酶[7-9]和木聚糖酶[10-12]在食品、飼料等工業中具有廣泛的應用。由于木聚糖酶和果膠酶的存在能夠更好地促進纖維素酶降解底物[13]，因此，發酵產物中不進行分離的纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶活力的高低也代表了菌株轉化利用植物細胞的能力[4]。黑曲霉（Aspergillus niger）是一種常見的無毒性曲霉屬真菌[14]，發酵后能夠產生多種生物酶[15-17]。因此，探索以黑曲霉為菌種發酵涼茶渣生產纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶等生物酶的廉價工藝，具有一定的經濟價值和社會意義。內切葡聚糖酶是纖維素酶的重要組成之一，本文擬通過單因素試驗和正交試驗，研究利用黑曲霉發酵涼茶渣生產內切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶的最佳工藝，為涼茶渣的資源化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉GIM3.562：廣東省微生物菌種保藏中心；涼茶渣：清遠加多寶草本植物科技有限公司。

3，5-二硝基水楊酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：Ruibio公司；羧甲基纖維素鈉（分析純）：Aladdin公司；果膠、D-木糖（優級純）：華邁科公司；D-一水半乳糖醛酸（分析純）：Fluka公司；木聚糖（分析純）：Sigma公司；其余試劑均分析純：國藥集團化學試劑有限公司。

5804R高速冷凍離心機：Eppendorf公司；XS205DU電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）公司；LDZX-50KB立式高壓滅菌器：上海申安醫療器械廠；BHC-1300IIA2生物安全柜、Elx50酶標儀：BioTek Instruments公司；BME生物顯微鏡：上海萊卡公司。

1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g去皮，切成塊，煮沸30 min，紗布過濾，加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，補水至1 000 mL，然后121℃濕熱滅菌20 min。

固態涼茶渣培養基：將新鮮涼茶渣曬干粉碎，取粉末2 g，加入硫酸銨0.08 g，葡萄糖0.04 g，磷酸二氫鉀0.01 g，磷酸氫二鉀0.008 g，水8 g，121℃濕熱滅菌20 min，滅菌后 pH 值為 5.03±0.01。

1.3 方法

在80%濕度，30℃的恒溫恒濕培養箱中，利用PDA平板培養基將黑曲霉培養120 h，連續傳代兩次。制備黑曲霉孢子懸液，利用血球板計數法，調節孢子濃度為2×109CFU/mL，將菌種按照10%接種量接種至固態涼茶渣培養基中，然后按照各部分設定的試驗條件進行培養。

1.3.1 單因素試驗

分別考察氮源種類（尿素、氯化銨、硫酸銨、豆粕和無補充氮源）、碳源種類（葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、糖蜜和無補充碳源）、含水量（65%～85%）、發酵時間（48h～144h）、浸泡液 pH 值（5.00～9.00）、溫度（28℃～37℃和室溫25℃）共6個因素對內切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶的活力影響。在單因素試驗、正交試驗以及驗證試驗中除特別說明外，培養基成分不變，硫酸銨含量、葡萄糖含量、含水量以及接種量均按涼茶渣的干重計算。

1.3.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，將內切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶的酶活力權重均設定為1，以3種酶的活力總和作為考察指標，對含水量A、浸泡液pH值B、發酵溫度C、發酵時間D共4個因素進行三水平正交試驗優化，各因素水平見表1。

1.3.3 酶活力測定

發酵結束后，向三角瓶中加入15 mL生理鹽水，振蕩后過夜；經過5 000 r/min離心10 min，采用DNS顯色法檢測上清液中內切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶活力[4，18]；沉淀烘干后即為發酵樣品干重。

1.3.3.1 酶活力測定方法

取底物溶液0.4 mL，發酵上清液0.1 mL，混勻后，40℃水浴進行酶促反應10 min；然后加入DNS 0.5 mL，再次混勻后，沸水浴10 min，以蒸餾水代替底物溶液為對照，測定特定波長吸光度，計算酶活力。

用0.2 mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH 5.0），配制6.25 mg/mL羧甲基纖維素鈉溶液為底物，用終濃度0、20、40、60、80、100 μg/mL 的葡萄糖制定標準曲線，測定530 nm的吸光度，計算內切葡聚糖酶活力[13]；用0.2 mol/L的磷酸氫二鈉-0.1 mol/L檸檬酸緩沖溶液（pH 5.0），配制0.5%的果膠溶液為底物，用終濃度0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL 的 D-半乳糖醛酸制定標準曲線，測定540 nm的吸光度，計算果膠酶活力[19]；用與配制果膠溶液相同的方法，配制0.5%的木聚糖溶液為底物，用終濃度 0、100、200、300、400、500、600 μg/mL的D-木糖制定標準曲線，測定550 nm的吸光度，計算木聚糖酶活力[20]。

1.3.3.2 酶活力計算

規定：某種酶在40℃時，每分鐘產生1 μmol產物的酶量為1個酶活力單位（U）。

酶活力計算公式如下。

式中：C0根據標準曲線，查得的酶促反應前還原糖濃度，μmol/mL；C1酶促反應后還原糖濃度，μmol/mL；V1參與反應的酶溶液體積，mL；V2酶溶液總體積，mL，包括發酵前培養基含水量，加入菌種以及調節pH值引入的水分，和發酵后加入的生理鹽水；t酶促反應時間，min；m 發酵樣品干重，g。

1.4 數據處理

采用SPSS 21軟件對單因素試驗中的同一種酶活力進行方差分析。以P＜0.05作為差異顯著標準；以P＜0.01作為差異極顯著標準。所有試驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 氮源種類對酶活力的影響

以2%葡萄糖為碳源，含水量為80%，分別向涼茶渣培養基中添加4%尿素、氯化銨、硫酸銨、豆粕和無補充氮源，31℃發酵72 h，考察氮源種類對內切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響見圖1。

圖1 氮源種類對酶活力的影響Fig.1 Effects of nitrogen sources on enzyme activity

從圖1可以看出，內切葡聚糖酶活力按照無補充氮源、豆粕、氯化銨（或尿素）、硫酸銨的順序極顯著增加（P＜0.01），其中氯化銨和尿素對應的內切葡聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05）；硫酸銨對應的果膠酶活力極顯著高于尿素、氯化銨、豆粕和無補充氮源對應的果膠酶活力（P＜0.01），其中尿素、氯化銨、豆粕對應的果膠酶活力無顯著差異（P>0.05），但是尿素對應的果膠酶活力顯著高于無補充氮源對應的果膠酶活力（P＜0.05）；硫酸銨對應的木聚糖酶活力極顯著高于尿素和氯化銨的木聚糖酶活力（P＜0.01），其中尿素和氯化銨的木聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05），但是極顯著高于豆粕和無補充氮源對應的酶活力（P＜0.01）。因此4%硫酸銨是黑曲霉發酵涼茶渣的適宜氮源。

2.1.2 碳源種類對酶活力的影響

以4%硫酸銨為氮源，含水量為80%，向涼茶渣培養基中分別添加2%的葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、糖蜜和無補充碳源，31℃發酵72 h，考察碳源種類對內切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響，結果見圖2。

圖2 碳源種類對酶活力的影響Fig.2 Effects of carbon source on enzyme activity

從圖2可以看出，葡萄糖、蔗糖和糖蜜對應的內切葡聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05），但是均極顯著高于α-乳糖和無補充碳源對應的內切葡聚糖酶活力（P＜0.01）；葡萄糖、蔗糖和糖蜜對應的果膠酶活力極顯著高于α-乳糖和無補充碳源對應的果膠酶活力（P＜0.01），其中蔗糖和葡萄糖對應的果膠酶活力無顯著差異（P>0.05），但是蔗糖對應的果膠酶活力顯著高于糖蜜對應的果膠酶活力（P＜0.05）；葡萄糖、蔗糖和糖蜜對應的木聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05），但是均極顯著高于無補充碳源對應的木聚糖酶活力（P＜0.01），其中葡萄糖和蔗糖對應的木聚糖酶活力顯著高于α-乳糖對應的木聚糖酶活力（P＜0.05）。α-乳糖對應的內切葡聚糖酶和果膠酶活力顯著低于無補充碳源的酶活力（P＜0.05），而且對應的木聚糖酶活力與無補充碳源的酶活力無顯著差異（P>0.05）。綜上所述，2%葡萄糖是黑曲霉發酵涼茶渣的較優碳源。

2.1.3 含水量對酶活力的影響

基質的含水量影響著胞外酶的分泌和轉移，影響菌體生長。一般來說真菌發酵時需要相對更低的含水量，如利用黑曲霉對三七渣進行固態發酵生產蛋白飼料時，含水量為60%[21]；利用黑曲霉和產朊假絲酵母發酵三七渣生產蛋白飼料時，含水量可以低至50%[22]。在本試驗中，向涼茶渣培養基補充4%硫酸銨，2%葡萄糖，31℃發酵72 h，考察65%～85%含水量范圍對內切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響，結果見圖3。

由圖3可知，65%和70%含水量對應的內切葡聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05），75%、80%和85%含水量對應的內切葡聚糖酶活力無顯著差異（P>0.05），但是65%和70%含水量對應的內切葡聚糖酶活力顯著高于75%、80%和85%含水量對應的內切葡聚糖酶活力（P＜0.05），極顯著高于85%含水量對應的內切葡聚糖酶活力（P＜0.01）；65%、70%和 75%含水量對應的果膠酶活力無顯著差異（P>0.05），但是極顯著高于85%含水量對應的果膠酶活力（P＜0.01），其中70%含水量對應的果膠酶活力最高，且顯著高于80%含水量對應的果膠酶活力（P＜0.05）；含水量對木聚糖酶活力沒有顯著影響（P>0.05）。因此，黑曲霉發酵涼茶渣的適宜含水量是70%。

圖3 含水量對酶活力的影響Fig.3 Effects of moisture content on enzyme activity

2.1.4 發酵時間對酶活力的影響

如果發酵時間過短，發酵不完全；發酵時間過長，菌種老化，產生有害的次級代謝產物，甚至造成菌體自溶[23]。向涼茶渣培養基補充4%硫酸銨，2%葡萄糖，溫度為31℃，含水量為80%，考察時間從48 h延長到144 h，對內切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響，結果見圖4。

由圖4可知，內切葡聚糖酶活力隨著時間延長先增加后降低，其中120 h對應的內切葡聚糖酶活力最高，且顯著高于48 h對應的內切葡聚糖酶活力（P＜0.05）；72 h 后果膠酶活力變化不顯著（P>0.05），但是144 h對應的果膠酶活力顯著高于48 h對應的果膠酶活力（P＜0.05）；96 h后木聚糖活力變化不顯著（P>0.05），但是均極顯著高于48 h和72 h對應的木聚糖酶活力（P＜0.01）。綜合分析，黑曲霉發酵涼茶渣適宜時間是120 h。

圖4 時間對酶活力的影響Fig.4 Effects of fermentation time on enzyme activity

2.1.5 浸泡液pH值對酶活力的影響

向涼茶渣培養基中補充4%硫酸銨，2%葡萄糖，含水量為80%，31℃發酵72 h，考察浸泡液pH值對內切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響，結果見圖5。

圖5 浸泡液pH值對酶活力的影響Fig.5 Effects of pH of soaking solution on enzyme activity

由圖5可知，發現浸泡液pH值從5.00變化到8.00時，內切葡聚糖酶活力無顯著變化（P>0.05），當浸泡液pH值為9.00（培養基pH值實測值約7.24）時，則顯著降低（P＜0.05）。隨著pH值從5.00變化到9.00時，果膠酶活力呈現“V”型變化，在pH值為7.00時最低。木聚糖酶活力隨pH值變化不大，但是pH值為8.00的酶活力顯著高于pH值為7.00時的酶活力（P＜0.05）。因此，黑曲霉發酵涼茶渣的較適宜pH值為8.0。

2.1.6 溫度對酶活力的影響

向涼茶渣培養基中補充4%硫酸銨，2%葡萄糖，含水量為 80%，發酵 72 h，考察 28、31、34、37℃以及室溫25℃對內切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響見圖6。

圖6可以看出，34℃內切葡聚糖酶活力極顯著高于25℃和37℃內切葡聚糖酶活力（P＜0.01）；31℃果膠酶活力極顯著高于25、28℃和37℃果膠酶活力（P＜0.01），顯著高于 34 ℃果膠酶活力（P＜0.05），而 34℃果膠酶活力顯著高于25、28℃和37℃果膠酶活力（P＜0.05）；34℃木聚糖酶酶活力極顯著高于25℃和37℃木聚糖酶活力（P＜0.01），顯著高于28℃木聚糖酶活力（P＜0.05）。因此，34℃是黑曲霉發酵涼茶渣產酶的較適宜溫度。

圖6 溫度對酶活力的影響Fig.6 Effects of temperature on enzyme activity

2.2 正交試驗

單因素試驗發現，發酵時間越長，含水量越低，酶活力越高，因此在正交試驗中將發酵時間延長至168h，含水量降低至60%，以探索更寬的時間和含水量范圍對內切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶活力的影響。向涼茶渣培養基中補充4%硫酸銨和2%葡萄糖，對含水量（A）、浸泡液pH（B）、溫度（C）以及發酵時間（D）4個因素進行3個水平正交試驗，結果見表2。

含水量（A）、浸泡液 pH（B）、溫度（C）以及發酵時間（D）對3種酶活力總和的極差（R）表現為：RD（10.28）>RC（9.21）>RB（4.74）>RA（2.65），因此，對3種酶活力總和的影響顯著性順序依次為發酵時間、發酵溫度、浸泡液pH值和含水量。

由表2可知，在A因素中，K2>K3>K1；在B因素中，K3>K2>K1；在C因素中，K1>K2>K3；在D因素中，K3>K2>K1。因此，各因素水平對3種酶活力總和的影響強弱順序是：A2>A3>A1，B3>B2>B1，C1>C2>C3，D3>D2>D1，即，當含水量為 70%（第2水平），浸泡液pH值為9.00（第3水平），發酵溫度為31℃（第1水平），時間為168 h（第3水平），對應的酶活力總和最高，因此該條件組合（A2B3C1D3）是3種酶的最佳生產工藝。

表2 涼茶渣固態發酵正交試驗結果Table 2 Orthogonal experiment result of herbal tea residue fermentation

2.3 驗證試驗

以硫酸銨為氮源，葡萄糖為碳源，菌種濃度為2×109CFU/mL，當菌種接種量為10%時，經驗證，含水量為70%，浸泡液pH值為9.00，發酵溫度為31℃，發酵168 h，即最佳工藝條件（A2B3C1D3）下，內切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶活力均較高，分別為（5.72±0.23）、（42.43±2.50）、（29.81±0.69）U/g，3 種酶活力總和為（77.96±1.08）U/g，與正交試驗結論相符。

3 討論與結論

黑曲霉發酵產酶是一個復雜的生物轉化過程，菌株種類、基質成分、培養條件、培養方式等對酶活力都有重要影響。經過紫外誘變的黑曲霉NW1在察氏培養基中發酵84 h，纖維素酶活力達到1.52 U/mL[24]，比未誘變的菌株提高了1.58倍。黑曲霉CICC40616發酵含有豆粕和木聚糖的培養基，經優化后木聚糖酶活力為82.43 U/mL[25]；黑曲霉WS003發酵豆粕和麩皮混合培養基，果膠酶活力達到81.06 U/mL[26]。

在檢測酶活力時，不同的對照設置方法會造成酶活力有較大差異。由于物料渣或其它培養基在發酵過程中產生了大量的還原糖，同時培養基自身含有一定的還原糖，因此，在利用3，5-二硝基水楊酸顯色法檢測發酵液的酶活力時，如果利用蒸餾水代替發酵液作為對照，必然會使發酵液中原有的大量還原糖都被計為酶促反應而產生的，造成酶活力偏高。對于本試驗，涼茶渣發酵液中還原糖濃度是內切葡聚糖酶產生的葡萄糖濃度的5倍以上，也是果膠酶反應產生的還原糖濃度，或木聚糖酶反應產生的還原糖濃度的50%甚至數倍。解決這個問題的辦法就是以蒸餾水代替底物溶液作為對照，或者以滅活的酶液作為對照[26-27]，這樣僅僅引入較小的干擾。

本文以黑曲霉GIM3.562為菌種對涼茶渣進行發酵，通過對較多單因素進行試驗考察，為涼茶渣發酵生產內切葡聚糖酶、果膠酶和木聚糖酶提供比較豐富的數據支撐；通過正交試驗優化，發現含水量為70%，浸泡液pH值為9.00，發酵溫度為31℃，發酵168 h，是產內切葡聚糖酶、木聚糖酶和果膠酶的最佳工藝，該工藝條件下，3種酶活力均較高，分別為（5.72±0.23）、（42.43±2.50）、（29.81±0.69）U/g，總和為（77.96±1.08）U/g。本研究為涼茶渣的資源化利用提供了參考。