葛根抗氧化活性有效部位的篩選研究

范琳，王苗，馬馨桐，沈穎昕，韓榮欣，張紅印，嚴(yán)銘銘，邵帥

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心，吉林 長(zhǎng)春 130117）

葛根為豆科植物野葛[Pueraria lobata（Willd.）Ohwi]的干燥根[1]，是我國(guó)常見的藥食同源植物，始載于東漢《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，具有解表退熱、生津、透疹、升陽(yáng)止瀉等功效。現(xiàn)代研究表明，葛根中主要活性成分異黃酮類在維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定性、保護(hù)腦神經(jīng)、抗氧化、防止肝腎損傷、改善代謝與免疫功能等方面均有顯著療效[3-5]。因此，藥用價(jià)值極高的葛根，有“亞洲人參”之美譽(yù)。2002年被國(guó)家衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)為“藥食同源”植物，其在抗氧化、輔助降血脂、輔助降血糖等功能性保健食品中均有應(yīng)用[6-10]。目前，葛根抗氧化活性的研究主要是葛根素、葛根異黃酮類、葛根多糖、葛根多肽等，而對(duì)葛根各提取物和有效部位抗氧化活性組分進(jìn)行篩選的研究較少。

研究表明，衰老、癌癥、糖尿病和神經(jīng)退行性等多種疾病都與過(guò)量自由基的產(chǎn)生有密切關(guān)聯(lián)[11-13]，所以添加抗氧化劑或自由基清除劑能有效抑制或緩解自由基對(duì)機(jī)體的不利影響。化學(xué)合成的抗氧化劑，雖然效果好，但同時(shí)也帶來(lái)了巨大的安全隱患。因此，從植物中尋求高效、安全的天然抗氧化劑成為研究熱點(diǎn)。

因此，本試驗(yàn)對(duì)葛根提取物和萃取物進(jìn)行活性成分含量測(cè)定，并以清除DPPH自由基、羥基自由基能力和總還原能力對(duì)各部位的抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為研究和開發(fā)葛根抗氧化產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

十二水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙酸乙酯、苯酚、鐵氰化鉀、冰醋酸、硫酸、甲醇：北京化工廠；正丁醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；二苯代苦味酰基：SIGMAALDRICH公司；維生素C對(duì)照品（批號(hào)20191018，純度為99.7%）：天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司；鄰菲啰啉、硫酸亞鐵、香草醛：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；中性氧化鋁：上海陸都化學(xué)試劑廠；Amberlite-XAD-2大孔樹脂：陶氏化學(xué)公司；無(wú)水葡萄糖：廣東汕頭市西隴化工廠；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品、人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；所用試劑均為分析純。

AB256-S 型電子天平：METTLER TOLEDO；UV-1700型紫外-可見光分光光度計(jì)：HIMADZU；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市佳美儀器有限公司；KQ-205B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DT5-2B型低速臺(tái)式離心機(jī)：北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。MFJ-W300粉碎機(jī)：北京利仁科技股份有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

2.1.1 葛根不同提取物的制備

將葛根飲片粉碎，過(guò)100目篩，稱取干燥粉末100g，分別以水、30%、50%、70%、95%乙醇為提取溶劑，回流提取3次，每次1.0 h，合并濾液，50℃減壓濃縮，得葛根提取物浸膏，將所得葛根水、30%、50%、70%、95%乙醇提取物干燥，備用，體外抗氧化能力測(cè)定時(shí)配制成不同濃度的溶液。

2.1.2 葛根萃取物的制備

稱取上述70%乙醇提取物適量，加適量蒸餾水溶解，加入等體積的乙酸乙酯與水層混勻進(jìn)行萃取，分離乙酸乙酯層與水層，水層繼續(xù)加入等體積水飽和正丁醇混勻，靜置，分離水飽和正丁醇層和水層。上述萃取操作分別重復(fù)3～4次，合并收集各相萃取液，減壓濃縮，干燥，即得葛根乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水相萃取物，備用，體外抗氧化能力測(cè)定時(shí)配制成不同濃度的溶液。

2.2 總黃酮、總皂苷、總多糖含量測(cè)定

2.2.1 總黃酮含量測(cè)定

參照魏鳳華等[14]總黃酮含量測(cè)定方法，以葛根素為對(duì)照品，乙醇為空白。根據(jù)葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中總黃酮含量是以每克提取物中含有相當(dāng)于葛根素的毫克數(shù)來(lái)表示（mg/g）。

2.2.2 總多糖含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]，以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品，采用苯酚-硫酸法進(jìn)行總多糖含量測(cè)定，結(jié)果以每克提取物中含有相當(dāng)于葡萄糖的毫克數(shù)來(lái)表示（mg/g）。

2.2.3 總皂苷含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]，以人參皂苷Re為對(duì)照，采用比色法檢測(cè)待測(cè)樣品中總皂苷的含量。結(jié)果以每克提取物中含有相當(dāng)于人參皂苷Re的毫克數(shù)來(lái)表示（mg/g）。

2.3 體外抗氧化能力測(cè)定

2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

取不同葛根提取物和萃取物溶液2 mL于試管中，加入2 mL濃度為0.004%的DPPH溶液，混勻于暗室反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1；空白組用2 mL蒸餾水代替葛根提取物或萃取物溶液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0；樣品對(duì)照組用2 mL甲醇代替DPPH溶液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。以甲醇作為空白調(diào)零，VC作為陽(yáng)性對(duì)照組。清除率計(jì)算公式：清除率/%=[A0-（A1-A2）]/A0×100。

2.3.2 羥基自由基清除率測(cè)定

采用鄰二氮菲法測(cè)定葛根提取物和萃取物對(duì)·OH的作用，以VC作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，取鄰二氮菲溶液1 mL分別加于各試管中，再加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）2 mL，再加入不同葛根提取物和萃取物溶液1 mL，混勻后加入FeSO4溶液1 mL，混勺，最后加入H2O2溶液1 mL，混勻。于37℃水浴1 h后在536nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1，用蒸餾水調(diào)零。以1mL蒸餾水代替樣品液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2；以1 mL蒸餾水代替H2O2溶液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0。清除率計(jì)算公式：清除率/%=（A1-A2）/（A0-A2）× 100。

2.3.3 總還原能力測(cè)定

取不同葛根提取物和萃取物溶液2.5 mL于試管中，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L的PBS溶液和2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液，50 ℃水浴反應(yīng) 20 min，冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，離心，取上清2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，搖勻，靜置，在700 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1；以2.5 mL蒸餾水代替2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液，其余步驟相同，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。以蒸餾水作為空白調(diào)零，VC作為陽(yáng)性對(duì)照組。總還原能力（A）計(jì)算公式：A=A1-A2。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用 Excel 2010、SPSS 20.0、OriginPro 2019 對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、相關(guān)性分析及圖像繪制。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

3 結(jié)果與討論

3.1 總黃酮、總皂苷、總多糖含量測(cè)定結(jié)果

本試驗(yàn)對(duì)葛根各提取物及萃取物中總黃酮、總皂苷、總多糖3種主要化學(xué)成分進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 葛根各提取物和萃取物中總黃酮、總皂苷和總多糖的含量Table 1 Contents of total flavonoids，total saponins and total polysaccharides in Pueraria lobata extract

由表1可知，水提取物與乙醇提取物相比，葛根總黃酮類成分主要存在于乙醇提物中，其中70%乙醇提取物中總黃酮和總皂苷成分含量最高，分別為326.1 mg/g和26.8 mg/g。總多糖成分則主要存在于水提物中，含量為183.9 mg/g，其次存在于70%乙醇提取物中。從簡(jiǎn)化制備工藝方面考慮，葛根用70%乙醇提取可以將其有效成分充分提取。

將葛根70%乙醇提取物水溶液加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取后，其總黃酮和總皂苷成分轉(zhuǎn)移至乙酸乙酯相中，含量分別為535.6 mg/g和71.5 mg/g，比70%乙醇提取物中含量增高，可知皂苷和黃酮類物質(zhì)更易溶于乙酸乙酯中，而葛根乙酸乙酯萃取物中總多糖含量與70%乙醇提取物中所測(cè)得值相比明顯降低，可知多糖類物質(zhì)不易溶于乙酸乙酯。由以上分析可知，70%乙醇提取物采用乙醇乙酸乙酯萃取的分離效果明顯。再進(jìn)一步以正丁醇進(jìn)行萃取，對(duì)所得正丁醇萃取物進(jìn)行活性成分含量測(cè)定，與70%乙醇提取物相比總皂苷在正丁醇中含量也增大，為51.2 mg/g。多糖類物質(zhì)在正丁醇及水相中含量明顯升高，含量分別為303.2 mg/g和319.0 mg/g。由此可知，乙酸乙酯和正丁醇作為70%乙醇葛根粗提物的萃取劑是良好的選擇，可明顯提高葛根有效物質(zhì)的含量。

3.2 體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

3.2.1 葛根不同溶劑提取物體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

以清除DPPH自由基、羥基自由基能力及總還原能力考察葛根不同溶劑提取物（濃度1.0 mg/mL）的體外抗氧化活性，其結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 DPPH自由基清除能力Fig.1 Scavenging ability of DPPH free radicals

由圖1～圖3可知，葛根不同溶劑提取物均有明顯的清除DPPH自由基的能力，其中70%乙醇提取物的DPPH自由基清除能力明顯高于其他提取物的清除能力。葛根醇提物均具有明顯的清除羥基自由基的能力，其中70%乙醇提取物的羥基自由基清除能力明顯高于其他提取物。葛根不同溶劑提取物均具有可觀的總還原能力。配制濃度為1.0 mg/mL的葛根水提物，30%、50%、70%、95%乙醇提取物溶液，測(cè)定總還原能力，結(jié)果70%乙醇提取物的總還原能力最高。因此，進(jìn)一步對(duì)70%乙醇提取物進(jìn)行抗氧化活性比較。

圖2 羥基自由基清除能力Fig.2 Scavenging ability of hydroxyl free radicals

圖3 總還原能力測(cè)定結(jié)果Fig.3 Results of total reducing ability

3.2.2 70%乙醇提取物萃取物體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

70%乙醇提取物萃取物體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果見圖4～圖6。

圖4 清除DPPH自由基能力測(cè)定結(jié)果Fig.4 Results of DPPH free radicals scavenging ability

由圖4～圖6可知，70%乙醇提物經(jīng)萃取后清除DPPH自由基能力最優(yōu)者為乙酸乙酯萃取物，其次為正丁醇萃取物。對(duì)各萃取物羥基自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定，各萃取物均有明顯的清除羥基自由基能力，且隨濃度增加，清除能力逐漸增大，其中乙酸乙酯萃取物對(duì)羥基自由基清除率最高，其次為正丁醇萃取物，可能與其中總黃酮含量較高有關(guān)，與DPPH清除能力大小順序相當(dāng)。由此可證明上述選擇的萃取劑是正確的，之后對(duì)其70%乙醇提取物的萃取物進(jìn)行總還原能力測(cè)定，隨濃度增加，總還原能力逐漸增大，其乙酸乙酯相的總還原能力最強(qiáng)，其次為正丁醇相。

圖5 羥基自由基清除能力結(jié)果Fig.5 Results of scavenging ability of hydroxyl radicals

圖6 總還原能力測(cè)定結(jié)果Fig.6 Results of total reducing ability

3.3 抗氧化能力與總黃酮、總皂苷、總多糖含量的相關(guān)性分析

抗氧化能力與總黃酮、總皂苷、總多糖含量的相關(guān)性分析見表2。

由表2可知，總黃酮的含量與DPPH·清除能力、羥基自由基清除能力有明顯的相關(guān)性，且其數(shù)值對(duì)比其他部位來(lái)說(shuō)最大，總皂苷的含量與抗氧化活性的相關(guān)性其次，總多糖含量與抗氧化活性相關(guān)性最低。由此可知葛根抗氧化能力與總黃酮的含量息息相關(guān)。總還原能力與總黃酮含量相關(guān)系數(shù)最大，與總多糖的含量相關(guān)系數(shù)最小，與DPPH·清除能力和羥基自由基清除能力的相關(guān)性分析結(jié)果一致。

表2 樣品中總黃酮、總皂苷、總多糖含量與其DPPH·清除能力、總還原能力和羥基自由基清除能力的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of total flavonoids，total saponins，and total polysaccharides in samples with their DPPH free radicals`scavenging ability，reducing ability，and hydroxyl radical scavenging ability

3.4 抗氧化能力的IC50值和總還原能力的A0.7值

葛根各萃取物DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力的IC50值和總還原能力的A0.7值見表3。

表3 DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力的IC50值和總還原能力的A0.7值Table 3 DPPH scavenging ability，hydroxyl radical scavenging ability on IC50values and iron ion reduction ability of A0.7value

由表3可知，乙酸乙酯萃取部位在抗氧化活性中IC50值最小，其次為正丁醇萃取部位。葛根70%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中含有大量總黃酮（535.6 mg/g），可以推測(cè)葛根中抗氧化能力最強(qiáng)的成分為黃酮類物質(zhì)。

4 結(jié)論

葛根作為一種藥食同源類植物，有很高的食用價(jià)值。本試驗(yàn)以葛根為原料，通過(guò)3種不同方法檢測(cè)葛根各提取物和萃取物的抗氧化活性并測(cè)定其總黃酮、總皂苷和總多糖含量。結(jié)果表明，葛根70%乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性明顯高于其它，且其中總黃酮含量也為最大，正丁醇萃取物次之，但仍有良好的抗氧化活性。由相關(guān)性分析結(jié)果得知總黃酮含量與3種抗氧化活性的相關(guān)性最大。葛根中乙酸乙酯萃取物中總黃酮含量高達(dá)535.6 mg/g，是抗氧化活性的最優(yōu)活性部位。由此可見，通過(guò)研究葛根乙酸乙酯萃取物結(jié)構(gòu)與生物活性效應(yīng)關(guān)系，進(jìn)一步研究其單一化合物成分并探討其發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制可對(duì)后期提取分離工藝提供一定的參考。