基于電子鼻與GC-MS分析精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性風味成分的差異性

貝翠平 ，柳艷霞 *，趙改名 ，張麗萍 ，張憶臻

（1.河南農業大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.河南省肉制品加工與質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450002）

美拉德反應是一種非酶促褐變反應，發生在食品的烹調、加工以及儲藏過程中，并對其風味、顏色、質構、營養等性質產生重要的影響[1-2]。除了對高溫條件的美拉德反應的研究外[3-6]，部分學者開始對溫和美拉德反應的產物展開了一系列研究[7-8]。溫和美拉德反應在發酵肉制品成熟過程中具有重要作用，其反應過程、反應產物的性質和反應溫度、時間、pH值等有關[9]，美拉德反應生成的產物非常復雜[10]，要建立單一模擬反應再對其反應物的性質及形成機理等方面進行研究[11]。精氨酸是堿性氨基酸，對香味形成有很大貢獻[12]，有研究報道金華火腿中的游離精氨酸可以和葡萄糖發生美拉德反應[13]，反應產物對火腿風味的形成具有很大的影響。現在精氨酸的研究大多都是對美拉德產物抗氧化性的研究[14-15]，而對于溫和條件下精氨酸-美拉德反應揮發性風味的變化研究較少。因此本文選取精氨酸和葡萄糖為反應底物，構建溫和條件下精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系。

固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用和電子鼻技術是研究食品中揮發性物質常用的檢測方法。氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）主要用于揮發性物質的定性和半定量分析[16]，電子鼻技術是一種用途廣泛、實時快速無損的風味物質分析檢測方法[17]；該技術已用于肉制品[18]、食用油[19]、酒[20]、水果[21-22]、牛奶[23]等食品的風味分析中。把GC-MS和電子鼻相結合研究溫和條件下精氨酸-美拉德反應體系揮發性物質的相關報道較少。為此，本研究以金華火腿成熟時最高溫度40℃為反應溫度，反應時間為10 d至60 d等6個時間點，采用電子鼻和GCMS技術對精氨酸-葡萄糖體系樣品揮發性成分進行分析，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）建立揮發性風味物質的評價模型，為研究溫和條件下精氨酸美拉德反應提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-（+）-葡萄糖（純度≥99.50%）、L-精氨酸：美國Sigma-Aldrich公司；2-甲基-3-庚酮（內標化合物）：艾吉析科技（上海）有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.0）：國藥集團化學試劑有限公司；0.22 μm濾菌膜：天津市津騰實驗設備有限公司。

1.2 儀器與設備

DNP-9272型電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗制備有限公司；PEN3便攜式電子鼻系統：德國Airsense公司；75μmCAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司；7890A/5975B氣相色譜-質譜聯用儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗方法

模擬體系的制備：將D-（+）-葡萄糖和L-精氨酸分別溶解于pH6.0、濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液，經0.22 μm濾菌膜過濾除菌后分別移取一定體積葡萄糖和氨基酸溶液于15 mL的頂空瓶中混合均勻，置于40℃的培養箱中恒溫培養。反應時間設置為10、20、30、40、50、60 d，樣品反應結束后置于-25 ℃冰箱終止反應，測定揮發性產物。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 揮發性產物GC-MS分析

內標溶液的配制：精確稱取2-甲基-3-庚酮25 mg溶于10.0 mL甲醇中，制成濃度為1.25 mg/mL的2-甲基-3-庚酮內標溶液，置于4℃冰箱備用。

揮發性產物固相微萃取：將固相微萃取裝置中的萃取頭在氣相色譜進樣口250℃處老化0.5 h。萃取頭插入15 mL頂空瓶并緩慢推出吸附纖維頭（注意不能碰到任何物質），50℃恒溫吸附45 min，隨即緩慢收回萃取頭后插入氣相色譜儀，進樣口溫度250℃處解析5 min。

色譜條件：DB-WAX毛細管色譜柱（30m×0.25mm×0.25 μm），載氣 He，流速 1 mL/min、不分流，恒流。進樣口和接口溫度250℃，升溫程序為：起始溫度40℃保持3 min；以5℃/min升溫至60℃，以8℃/min升溫至180℃，以10℃/min升溫至240℃，保持6 min。

質譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，燈絲電流 100 μA，掃描質量范圍：33～400 m/z。

數據分析：將GC-MS分析圖譜經計算機和人工把檢出的每個峰與NISTDEMO圖譜庫進行比較，相似指數（similarity index，SI）在800以上者為確定的化合物；通過計算待測揮發物與內標物的峰面積之比求得其濃度，計算公式如下。

濃度/（ng/g）=峰面積比（揮發物/內標物）×1.25 μg（內標物）×1 000/6g（樣品質量）

1.3.2.2 揮發性產物電子鼻分析

電子鼻由10種金屬氧化物傳感器構成，每種傳感器對不同種類物質的敏感性存在差異，具體性能如表1 所示[24]。

表1 化學傳感器及相應的敏感物質類型Table 1 Chemical sensors and the corresponding types of volatile substances

參照黨亞麗[25]的試驗方法，將15 mL頂空瓶用3層保鮮膜封口，將樣品在50℃恒溫水浴鍋中平衡30 min，干燥空氣作為載氣，采樣時間間隔為1 s，清洗時間120 s，歸零時間5 s，樣品測定時間80 s，進樣流速為300 mL/min。

1.4 數據處理

試驗數據采Origin2018和SPSS25進行處理與統計分析，并采用Origin2018軟件繪制聚類熱圖和傳感器堆積圖。

電子鼻數據分析：采用SPSS25進行PCA和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）分析，將數據標準化后確定特征根、特征向量，根據各主成分值和主成分貢獻率得出各個反應時間揮發性成分的評價模型，計算出不同反應時間樣品的綜合得分。

2 結果與分析

2.1 精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系電子鼻分析

2.1.1 PCA分析

PCA是將電子鼻數據進行降維處理，將主要信息保留在幾個不相關的主成分中[26]。一般前2個主成分包含了原始數據的主要信息[27]。旋轉后的載荷因子見表2。

表2 旋轉后的載荷因子Table 2 Load factor after rotation

由表2可知，精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系第1主成分主要反映氮氧化物和硫化合物等化合物信息，第2主成分主要反映芳烴化合物、硫的有機化合物和氫化物等信息，此結果和張鳳梅等[28]的研究結果存在差異，可能是由氨基酸的種類和性質不同造成的。精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性產物主成分分析見圖1。

圖1 精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性產物主成分分析Fig.1 Principal component analysis of volatile products in Maillard reaction system of arginine-glucose

由圖1可知，主成分1的貢獻率為69.242%，主成分2的貢獻率為19.84%，累計貢獻率為89.082%，因此，應選用前2個主成分的數據作為數據分析的有效成分。10 d和20 d、30 d和40 d、50 d和60 d 3組相鄰的時間點數據在主成分2上較為接近，但在主成分1上差異明顯，說明在20 d和30 d之間、40 d和50 d之間反應生成的物質發生了明顯的變化。

2.1.2 LDA分析

LDA是利用所有傳感器的信號研究樣品所屬類別的一種統計方法。精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性產物LDA分析見圖2。

圖2 精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性產物LDA分析Fig.2 LDA analysis of volatile products in the Maillard reaction system of arginine-glucose

由圖2可知，LDA1和LDA2的貢獻率分別為66.9%和28.4%，累計貢獻率達到95.3%基本代表原始變量的絕大部分信息。在LDA1上50 d和60 d與其它時間點距離較遠，說明在反應過程中揮發性物質豐度逐漸減小。而30 d與40 d樣品在LDA1上距離較近，但在LDA2上則可完全分開。通過電子鼻對不同反應時間的揮發性成分進行分析，發現PCA和LDA均能很好地區分30 d和40 d的樣品。但利用LDA不能很好地區分其它反應時間之間的揮發性成分，PCA則能進行明顯區分，說明PCA是辨別不同反應時間精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性成分差異的有效分析方法。

2.2 精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性產物GCMS分析

2.2.1 揮發性成分種類及含量分析

揮發性成分種類及含量分析見表3和表4。

表3 精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系不同反應時間揮發性化合物分析結果Table 3 Analysis results of volatile compounds in the Maillard reaction system of arginine-glucose at different reaction times

續表3 精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系不同反應時間揮發性化合物分析結果Continue table 3 Analysis results of volatile compounds in the Maillard reaction system of arginine-glucose at different reaction times

表4 不同反應時間精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性成分種類數與含量Table 4 Number and content of volatile components in Maillard reaction system of arginine-glucose with different reaction times

由表3和表4可知，6個反應時間點共檢測出50種揮發性物質，大致可分為6大類，分別是醇類、醛類、酮類、酯類、烴類、其它。10、20、30、40、50 d 和 60 d 中分別檢測到 27、19、23、19、23 種和 18 種化合物。20 d 時總揮發性成分含量最高（1 989.1 ng/g），其次是10 d（1 848.5 ng/g）、60 d（1 472.39 ng/g）、40 d（1 442.7 ng/g）、30 d（1 373.5 ng/g）及 50 d（942.07 ng/g）。其中含量最高的是酯類，主要包含乙酸乙酯、亞硝酸仲丁酯和己酸-2-苯乙酯；其他類物質次之，主要包含乙二醇二乙醚和乙醚。由表4可知，10 d生成的揮發性化合物種類最多（27種），其次是30 d和50 d（23種）。

醇類是精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性物質中含量排名第三的物質，其前體物質主要是多不飽和脂肪酸[29]。在20 d中醇類物質含量最高到可達到389.7ng/g，其中乙醇是主要揮發性物質（185.04 ng/g），其次是（3-叔丁基-5-羥基甲基-環己-2-烯基）-甲醇和1-環己基-2-丁烯-1-醇。30 d醇類含量達到226.48 ng/g，僅次于 20 d。

醛類物質氣味閾值較低，具有脂香氣味，是肉類香氣的指標[30]。但是精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系中醛類含量較少，對總體揮發性成分的貢獻暫不能確定。但有研究表明許多Strecker醛本身及其反應產物對于食品香料有著非常重要的作用[31]。醛類物質在10 d到20 d呈上升趨勢，隨著反應時間的延長含量卻減少，可能是醛類和后續生成的物質發生反應，從而導致醛類含量的下降。糠醛含量是表征食品變質程度、食品儲藏時間長短的一項重要指標[32]，其中甘氨酸對半胱氨酸-木糖[33]反應也檢測到了糠醛的存在。己醛[34]具有青草味、香脂，最高含量達到111.96 ng/g，而鄧仕彬[35]的研究中也檢測到己醛的存在，含量達到2.12 ng/mL，兩者因為體系不同導致己醛含量也不盡相同。

酮類的來源一方面可能是由醇類氧化，另一方面可能是脂類分解產生的[36]，短鏈酮類具有脂香和焦香香氣而長鏈酮類則呈現花香氣息[37]。酮類物質在20 d和50 d時生成的較多，是美拉德反應的重要產物[38]，由表4可知醛類物質的含量高于酮類物質，由于酮類的閾值一般高于其同分異構體的醛類[39]，所以酮類對風味的貢獻相對于醛類物質作用相對不大。隨著反應時間的延長，酮類物質的含量20 d和50 d較高，分別為114.51ng/g和104.15 ng/g。丙酮是重要的美拉德反應產物，其含量在20 d時達到最高96.52 ng/g，而崔和平[40]的研究因氨基酸種類和處理方式不同導致檢測到丙酮含量達到 32.05 （μg/L）。N-（4-bromobut-1-yl）piperidin-2-one在反應中的不同時間點均有產生，（1S-順）-1-（2，2，6-三甲基環己基）乙酮只有在 50 d時檢測到，而丙酮在20 d和50 d中檢測到，其中苯乙酮具有杏仁味和堅果味，在袁林等[41]的研究中也有發現，且相對含量達到0.95%。有研究表明酸和醇發生酯化反應產生酯類物質[42]，且酯類物質能夠使食品具有甜香氣味和輕微油脂氣味[43]。由表4可知，精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系中酯類化合物含量最高，此結果與張佳敏等[44]研究結果一致。酯類物質中含量較高的是乙酸乙酯，具有水果味、甜味[45]。

酯類物質在10 d和20 d中含量較多而在50 d時含量最少，可能是隨著反應時間的延長，一些復雜的化學反應導致了酯類在一定程度上的降解。由表3可知，精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系中共檢測出烴類化合物有11種。隨著反應時間的延長，烴類物質大致呈現下降趨勢，且在30 d時達到最低，50 d次之。烴類物質在精氨酸-葡萄糖美拉德體系中含量較低但是閾值較高，在整體上對精氨酸-葡萄糖美拉德體系揮發性成分影響不大。但是有一些烴類也具有獨特的風味，如在50 d中檢測到的（+）-檸檬烯具有新鮮橙子香氣及檸檬香氣[46]。不同反應時間聚類熱圖見圖3。

聚類熱圖能直觀地表明6個時間點中各特征香氣濃度的差異。由圖3可知，根據橫向分析發現10 d和50 d 特征香氣成分差異明顯，可分為Ⅰ（10d）、Ⅱ（20、30、40、60 d）和Ⅲ（50 d）三大類。根據縱向分析發現，可將特征香氣成分分為Ⅰ[AD～J即（+）-檸檬烯～戊醛]、Ⅱ（AF～B即 2，4-二甲基己烷～1-丁醇）、Ⅲ（AC～C即乙基苯～4-氨基-1-戊醇）和Ⅳ（O～A即丙酮～乙醇）4個系列。Ⅰ系列含有戊醛和糠醛，呈現刺激性氣味都是50 d獨有的物質。Ⅱ系列多以醇類酯類為主；Ⅲ系列含有的己醛[34]和乙酸乙酯[47]具有青草味、香脂味和蘋果果皮味，反應10 d和20 d的樣品含量最多，可能是隨著反應時間較長，生成的物質與二者反應，使得含量下降。Ⅳ系列含有乙醇和丙酮。

圖3 精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系不同反應時間聚類熱圖Fig.3 Clustering heat map of arginine-glucose Maillard system with different reaction times

2.2.2 PCA分析

2.2.2.1 不同反應時間的精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性成分PCA

主成分的特征值與貢獻率見表5，主成分的特征向量與載荷矩陣見表6。

表5 主成分的特征值及貢獻率Table 5 Eigenvalues and contribution rates of principal components

表5可知，第1、第2、第3主成分的貢獻率分別為58.234%、25.638%、11.96%，累計貢獻率達到95.832%，基本代表原始變量的絕大部分信息。主成分的載荷值的大小代表該主成分對該類物質反映程度的大小[48]。

由表6可知，PC1主要反映醇、醛和酮類等指標；PC2主要反映的是烴類化合物；PC3主要反映的是酮類化合物。PC1與醇類呈正相關；PC2與烴類呈正相關；PC3與酮類呈負相關。

表6 主成分的特征向量與載荷矩陣Table 6 The eigenvectors and loading matrix of the principal components

2.2.2.2 揮發性成分品質評價模型的建立

根據主成分6類物質的特征向量，可以得到各個主成分的得分，分別用Y1、Y2和Y3表示，進行揮發性成分含量的綜合評價，得到精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性成分的線性關系式分別為：Y1=0.530X1＋0.483 X2＋ 0.438 X3＋ 0.405X4＋0.355 X5-0.068 X6；Y2=-0.067 X1+0.281X2-0.108 X3－ 0.362 X4＋0.414 X5+0.777 X6；Y3=0.063 X1-0.270X2-0.645 X3+0.436 X4+0.558X5-0.080 X6。

6類物質的權重分別為0.582、0.256、0.120。將這6個指標分別與權重相乘，結果相加得出Y綜合值，建立精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性成分評價模型：F=0.582F1＋ 0.256F2＋ 0.120F3，得到的綜合得分見表7。

由表7可知，20 d的第1主成分得分最高，10 d其次，第2和第3主成分得分最高的均是10 d。由評價模型可得，精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系揮發性化合物綜合得分排名依次為 20、10、60、40、30、50 d。所以，反應時間為20 d時精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系的揮發性成分品質最好。

表7 標準化后主成分綜合得分Table 7 The comprehensive scores of principal and principal components after standardization

3 結論

電子鼻結果與GC-MS的結果互相映證，得出不同反應時間下精氨酸-葡萄糖美拉德反應體系樣品揮發性成分和含量存在差異。PCA可以良好區分不同反應時間的樣品，而LDA僅能較好地區分30 d和40 d的樣品。利用GC-MS技術分析了不同反應時間揮發性物質的含量與組成，共檢測出50種揮發性化合物，在10、20、30、40、50 d 和 60 d 中分別檢測到 27、19、23、19、23、18 種化合物，可分為醇類、醛類、酮類、酯類、烷烴類和其它類化合物，其中20 d的揮發性物質含量最高，達到1 989.1 ng/g。通過PCA建立的揮發性成分綜合評價模型，得出20 d揮發性成分含量得分最高。