嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種共生關系的研究進展

崔欣，孫亞琳，王開云，王哲，梁琰，徐振上，王婷

（齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院，山東 濟南 250353）

酸奶是最受歡迎的發酵乳，通常是由嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）共培養使牛奶酸化和凝膠化而成[1]。兩菌在牛乳環境中的協同共生是一個非常復雜的相互作用體系，產生多種相互作用關系。研究表明，兩菌混合發酵較單一菌種發酵更有利于酸奶風味的形成。本文從主要代謝途徑、脲酶、NADH氧化酶、谷胱甘肽、雙組分系統等方面論述了兩菌的協同共生關系，并通過探究兩菌共生時產酸能力、產黏能力及風味物質的產生等變化，闡明兩菌共生對酸奶風味形成的影響，從而為研究發酵劑菌株的共生關系及提高酸奶的品質提供理論指導。

1 兩菌混合發酵過程中的共生關系

1.1 營養水平的共生關系

1.1.1 主要代謝途徑

1.1.1.1 蛋白質代謝

S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus生長所需氮源主要為小分子肽類和氨基酸，雖然牛乳中蛋白質總量較高，但小分子肽類和游離氨基酸的含量較低，從而限制兩菌生長。L.delbrueckiisubsp.bulgaricus含有胞外蛋白酶PrtB，兩菌共同培養時，能夠降解酪蛋白產生甲硫氨酸、組氨酸、脯氨酸等大量氨基酸[2-4]。而S.thermophilus的蛋白酶PrtS降解酪蛋白能力弱，不能直接從牛奶環境中獲取生長所需氨基酸，但與L.delbrueckii subsp.bulgaricus共同培養后，可通過amiABCDE（一個負責寡肽轉運的操縱子）上調等方式獲取L.delbrueckii subsp.bulgaricus水解產生的氨基酸，促進 S.thermophilus的生長[5-8]。除此之外，S.thermophilus能合成L.delbrueckii subsp.bulgaricus無法合成的纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸3種支鏈氨基酸（branched chain amino acid，BCAA），在共同培養生長高峰期，控制3種BCAA合成的酶含量均有所提高，故 L.delbrueckii subsp.bulgaricus通過促進 S.thermophilus合成BCAA滿足彼此對氨基酸的需求[3，9]。綜上所述，在共生條件下兩菌對氨基酸的需求得到滿足，從而促進了發酵。而且很多的氨基酸和短肽能夠形成乳制品特有的風味[10]，這對提高酸奶的品質具有重要意義。

1.1.1.2 糖代謝

S.thermophilus依靠乳糖通透酶（lactose enzyme，LacS）運輸乳糖，并通過β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，LacZ）水解產生葡萄糖和半乳糖[11-13]。但S.thermophilus對半乳糖的代謝較弱，多數只能利用葡萄糖經糖酵解（embden-meyerhof pathway，EMP）途徑產生乳酸[14-15]。L.delbrueckii subsp.bulgaricus依靠磷酸轉移酶系統（phosphotransferase system，PTS）運輸乳糖，幾乎不利用半乳糖[2，8]。LIU等的研究表明，兩者混合發酵時S.thermophilus為L.delbrueckii subsp.bulgaricus提供丙酮酸，經發酵后產生乳酸[16]。乳糖被分解為葡萄糖和半乳糖，葡萄糖被用以產生乳酸，乳酸產生時pH值降低有利于酪蛋白沉降，并且半乳糖較乳糖容易被人體吸收。綜上所述，乳酸和半乳糖的產生提高了兩菌共同發酵時產酸產黏能力，有助于酸奶獨特風味的形成，有助于促進人體對酸奶中營養成分的吸收。

1.1.1.3 核苷酸堿基代謝

核苷酸是合成RNA和DNA的前體，在細胞代謝中起重要作用[5]。其合成過程分為兩步：先由5-磷酸核糖-1-焦磷酸（phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP）合成次黃嘌呤核苷酸（hypoxanthine nucleotide，IMP），再由IMP經過不同的途徑形成腺嘌呤核苷酸（adenosine monophosphate，AMP） 和鳥嘌呤核苷酸（guanosine monophosphate，GMP）。在牛乳環境中，限制S.thermophilus生長的主要因素是嘌呤核苷酸類物質。混合發酵時，S.thermophilus中合成嘌呤核苷酸類物質相關酶的表達受抑制，同時編碼嘌呤類物質轉運蛋白的基因出現超表達現象，由此得出L.delbrueckii subsp.bulgaricus為S.thermophilus提供了嘌呤核苷酸類物質[17]。限制L.delbrueckii subsp.bulgaricus生長的主要因素是甲酸和葉酸。甲酸是嘌呤合成的前體，L.delbrueckii subsp.bulgaricus缺少丙酮酸甲酸裂解酶，無法合成嘌呤類物質的前體甲酸[18]。兩菌混合發酵時，S.thermophilus可在缺氧條件下利用EMP途徑中的丙酮酸為L.delbrueckii subsp.bulgaricus提供甲酸[19]。此外葉酸是參與嘌呤和氨基酸生物合成的輔助因子，基因組序列分析顯示L.delbrueckii subsp.bulgaricus中葉酸的生物合成途徑不完整[20-22]。兩菌共生時，S.thermophilus能夠為L.delbrueckii subsp.bulgaricus提供生長所需的葉酸。綜上所述，兩菌混合發酵時，S.thermophilus為L.delbrueckii subsp.bulgaricus提供了甲酸和葉酸，故L.delbrueckii subsp.bulgaricus可以大量合成嘌呤類物質，滿足二者需求，從而有利于兩菌共生[23]。

1.1.2 脲酶

脲酶能夠催化尿素分解為氨和二氧化碳，多數研究表明S.thermophilus是唯一顯示出脲酶活性的乳酸菌[24]。無論是單獨培養還是與L.delbrueckii subsp.bulgaricus共同培養，脲酶都是限制其生長的關鍵因子[25-27]。脲酶能促進S.thermophilus乳糖的利用和乳酸、乙醛的產生[26-27]。而且脲酶的活性越高，發酵過程中消耗的乳糖越多，產生的乳酸越多[27]。二氧化碳參與多數L.delbrueckii subsp.bulgaricus的酸化，Yamauchi等研究發現，兩菌共生時S.thermophilus的脲酶活性通過影響二氧化碳的含量，從而影響對二氧化碳響應的L.delbrueckii subsp.bulgaricus的酸化[24]。兩菌共培養物的有效酸化對于酸奶地發酵非常重要，有效的酸化可以防止污染物的擴散并降低發酵過程的生產成本[24]。

1.1.3 其他

兩菌共培養過程中，長鏈脂肪酸（long chain fatty acid，LCFA）對兩菌共生作用也存在影響，如圖1所示。Partanen等[28]表明L.delbrueckii subsp.bulgaricus缺乏LCFA從頭合成所需的部分生物途徑，外源添加的LAFC對其生長有刺激作用。Sander等[29]認為S.thermophilus能合成LCFA，兩菌共生時S.thermophilus能夠向L.delbrueckii subsp.bulgaricus提供LCFA。

圖1 酸奶發酵劑嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的共生關系Fig.1 Symbiotic relationship between yogurt starter Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus

盡管兩菌在牛乳環境中共生的現象非常普遍，但也有大量研究表明，部分S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus之間存在不同程度的拮抗作用。可能是受3個方面因素的影響：一是兩菌在產酸、酸脅迫耐受能力及最適生長條件等方面存在差異；二是兩菌生長過程中均需要大量的營養物質，故兩者之間存在競爭；三是L.delbrueckii subsp.bulgaricus代謝生成細菌素等生長抑制物會對S.thermophilus產生抑制，從而影響兩菌之間的協同效果[30-31]。因此，S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus在牛乳環境中的共生作用機制還有待進一步的研究。

1.2 抵抗環境脅迫水平的共生關系

1.2.1 抵抗氧脅迫——NADH氧化酶

S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus是兼性厭氧菌，溶解氧（dissolved oxygen，DO）對兩菌的生長存在影響。DO濃度超過1 mg/kg時即可抑制發酵[32-33]。YASUKO等[33]通過測定發酵乳中H2O2和DO濃度，發現兩菌共生時DO主要由S.thermophilus去除。但由于S.thermophilus缺乏血紅素導致無法合成細胞色素氧化酶，其通過NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）消耗DO。NADH氧化酶是一種氧化還原酶類，能夠催化NADH氧化為NAD+并消耗氧氣。MARTY等[34]研究發現，NADH氧化酶催化反應過程中有H2O2生成。YASUKO等通過構建S.thermophilus NADH氧化酶敲除突變體（△nox）證明了NADH氧化酶是主要耗氧酶[33]。綜上所述，兩菌共生時通過NADH氧化酶消耗DO值進而主動產酸，有利于兩菌共生。

1.2.2 抵抗氧、酸脅迫——谷胱甘肽

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵連接的三肽化合物，具有清除自由基、提高細胞脅迫抗性等作用[35-37]。與普通寡肽相比，GSH的特殊性在于它有一個γ-肽鍵，在生物體內不會被一般的肽酶水解，從而提高其穩定性[38]。S.thermophilus不僅可以吸收外源的GSH，還可以通過自身的谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GshF）一步合成GSH。WANG等研究證明不論S.thermophilus外源吸收還是自身合成的GSH均能保護其自身抵抗氧、酸脅迫[39-40]。同時，在研究中還發現，S.thermophilus將對其自身有利的GSH轉運出胞外，提供給自身不能合成GSH的L.delbrueckii subsp.bulgaricus，促進L.delbrueckii subsp.bulgaricus的生長和抵抗酸脅迫能力，即兩菌有建立在GSH基礎上的共生作用[39]。

1.3 雙組分系統

雙組分系統（two-component system ，TCS）是細菌進行環境傳感和信號轉導的重要機制之一[41]。TCS主要是由檢測刺激的組氨酸蛋白激酶（histidine protein kinase，HPK）和充當轉錄調節因子的應答調節蛋白（response regulator，RR）兩部分組成，它們通過磷酸化和去磷酸化反應進行信號的傳遞[42]。THEVENARD等[43]研究發現，S.thermophilus LMD-9的基因組中存在8個反應調節因子，當與L.delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC11842共培養時誘導了rr02和rr09兩個反應調節子的顯著表達。這表明兩菌共生時存在L.delbrueckii subsp.bulgaricus誘導S.thermophilus的調節變化。徐婷婷等[44]研究發現，混合發酵時兩菌部分TCS表達量發生明顯變化，其中TCShpk1/rr1對L.delbrueckii subsp.bulgaricus CH3的生長、產乙醛、產黏能力具有顯著下調作用。但這些都是從TCS角度揭示了S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus兩菌的共生關系，尚未闡明TCS與兩菌的共生機制，因此還有待進一步的研究探討。

2 兩菌共生對酸奶品質的影響

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）發酵牛奶時，會生成乳酸和其他揮發性物質，這些物質相互作用，產生具有獨特質地和口感的酸奶[45]。目前用于制作酸奶的傳統發酵劑是S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus，發酵劑之間的關系對發酵乳品質產生較大影響。相比于單一發酵，兩菌混合發酵具有產酸快、產黏好、風味濃郁等優良特點。因此探究S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus共生過程中的產酸、產黏和風味物質的產生，對提高酸奶品質具有重要意義。

2.1 產酸

S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus共生時產生多種酸，對酸奶品質影響較大的主要為乳酸。其主要產酸機制為兩菌將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，葡萄糖經EMP途徑和同型乳酸發酵轉化為乳酸（占轉化產物的85%～98%），使牛乳得到有效酸化[46]。乳酸菌的產酸分兩個階段，即發酵產酸階段和后酸化階段。發酵產酸是指酸奶未包裝前發酵過程中LAB的產酸。在這一時期內，S.thermophilus優先生長，隨pH值降低生長速度逐漸變慢，而L.delbrueckii subsp.bulgaricus生長速度逐漸加快。第二階段后酸化階段指包裝后貯存和運輸過程中酸奶產酸的階段。但由于該過程溫度較低，故酸度增長趨于緩和。綜上所述，兩菌在牛乳中共同培養時，S.thermophilus在發酵前期產酸過程中發揮重要作用，使pH值降低，有效促進L.delbrueckii subsp.bulgaricus 生長[47]。而 L.delbrueckii subsp.bulgaricus產生的多肽和游離氨基酸能夠促進S.thermophilus的生長繁殖和產酸[48]。從產酸特性來看，兩菌之間的共生關系促進了彼此的生長繁殖和產酸，故兩菌混合發酵的產酸能力較單一菌種發酵強，所以會對酸奶的品質和風味產生一定影響[23]。

2.2 產黏

酸奶黏度的增加有兩個原因：一是兩菌混合發酵產酸使pH值降低，有利于酪蛋白的沉淀；二是S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus產生的胞外多糖（exopoly saccharides，EPS）多聚物可作為黏膠劑、增稠劑[49-50]。EPS是微生物在生長代謝過程中分泌到胞外的一類糖類化合物，具有改善腸道微生態的益生特性。在發酵過程中，乳酸菌會產生EPS，它能將LAB與酪蛋白連接在一起，使酸奶具有細膩爽滑的口感[51]。由于S.thermophilus分泌的EPS較多，對酸奶質構特性影響較大，故酸奶黏度隨發酵劑中S.thermophilus所占比例的增加呈上升趨勢[46，52]。雖然L.delbrueckii subsp.bulgaricus分泌的EPS少，酸奶黏度低且有顆粒感，但兩菌共生時L.delbrueckii subsp.bulgaricus產生的代謝產物能夠促進S.thermophilus的生長和EPS的分泌，從而使得酸奶凝乳狀態均勻[29，53]。

2.3 產風味物質

S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus在發酵過程中通過相互作用產生的乳酸和多種揮發性芳香類化合物賦予了酸奶特有的風味和口感。目前已發現一百多種對酸奶風味產生重要影響的物質，其中起關鍵作用的有乙醛、雙乙酰和乙偶姻等[54]，它們通過多種途徑（圖2）生成，使酸奶的口感更加獨特。乙醛產生的一個重要代謝途徑是具有glyA基因編碼的絲氨酸羥甲基轉移酶，能夠催化蘇氨酸生成乙醛[55]。白娜等[56]研究推測，基因 pdc（編碼丙酮酸脫羧酶）、ald（編碼乙醛脫氫酶）和pdh（編碼丙酮酸脫氫酶）具有促進乙醛合成的作用，而基因ldh（編碼乳酸脫氫酶）可能不利于乙醛含量的積累。雙乙酰的生成主要來源于檸檬酸代謝途徑和糖酵解代謝途經。其中α-乙酰乳酸是雙乙酰的前驅體，可以通過氧化脫羧反應生成雙乙酰[57]。通過過量表達α-乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸合成酶等基因，能夠增加雙乙酰的產量[57]。但雙乙酰具有不穩定性，在雙乙酰還原酶的作用下能夠生成乙偶姻，影響酸奶的發酵風味。

圖2 影響酸奶發酵風味物質的產生途徑Fig.2 The production route of flavoring substances affecting yogurt

3 總結

發酵劑是成功發酵的關鍵，其特性直接影響產品品質。酸奶常用的發酵劑為S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus，兩菌在牛乳環境中形成的共生關系是非常復雜的作用體系，一方面體現在營養供給的共生關系，如丙酮酸、甲酸、葉酸、脲酶、嘌呤等都發揮了積極的促進作用；另一方面體現在抵抗環境脅迫的共生關系，如NADH氧化酶和谷胱甘肽能夠分別抵抗氧脅迫和酸脅迫。同時，乳酸、胞外多糖、乙醛、乙偶姻、雙乙酰等促進了酸奶發酵風味的形成。以上這些都是兩菌共生對酸奶發酵的積極作用，但有研究表明兩菌共生過程中還存在不同的拮抗作用[30-31]，且兩菌共生的作用機制還未完全闡明，特別是在抵抗脅迫方面。因此，繼續深入研究酸奶發酵劑S.thermophilus和L.delbrueckii subsp.bulgaricus的共生關系，將有助于提高酸奶品質、滿足消費者需求。同時大量研究表明，酸奶在改善人體腸道環境方面有著積極作用，未來在飲食治療腸道菌群失衡和生物工程菌綜合利用方面有著重要的應用價值。