雷公藤紅素對(duì)胃癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)活力及增殖、凋亡基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

李佳 楊曉丹 劉永葉

胃癌是我國(guó)發(fā)病率最高的消化道惡性腫瘤,由其引起的死亡率居所有惡性腫瘤的第四位。手術(shù)切除是目前胃癌的首選治療手段,聯(lián)合術(shù)后輔助化療雖然能夠延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間,但患者在術(shù)后發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的幾率仍高達(dá)80%,5 年生存率也僅為30%～40%［1,2］。近年來(lái),中藥在惡性腫瘤治療中的價(jià)值受到了越來(lái)越高的重視,多種中藥具有高效低毒的特點(diǎn)。雷公藤紅素(celastrol,Cel)是在中藥雷公藤中提取得到的天然活性物,屬于醌甲基三萜類化合物,具有廣泛的抗腫瘤活性［3］。已有研究報(bào)道,雷公藤紅素對(duì)卵巢癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)具有抑制作用［4,5］,但關(guān)于該藥物在胃癌治療中的應(yīng)用價(jià)值尚不明確。為了明確雷公藤紅素用于胃癌治療的潛在價(jià)值,本研究具體分析了雷公藤紅素對(duì)胃癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)活力及增殖、凋亡基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,具體如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 胃癌細(xì)胞株BGC823 購(gòu)自ATCC 公司,DMEM 購(gòu)自Gibco 公司,FBS 購(gòu)自杭州四季青公司,MTS 細(xì)胞生長(zhǎng)活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega 公司,mRNA 表達(dá)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱及離心機(jī)購(gòu)自Thermo 公司,酶標(biāo)儀及PCR 儀均購(gòu)自Bio-rad 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞分組及培養(yǎng) BGC823 細(xì)胞用含有10%FBS 的DMEM 進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),每2 天更換1 次培養(yǎng)液,待細(xì)胞密度生長(zhǎng)至80%左右時(shí)用胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代；取傳代后的第6～10 代細(xì)胞進(jìn)行分組,根據(jù)后期處理不同分為空白對(duì)照組(用不含F(xiàn)BS 的DMEM處理)和0.5 μmol/L Cel組(用含有0.5 μmol/L雷公藤紅素的DMEM 處理)、1.0 μmol/L Cel 組(用含有1.0 μmol/L雷公藤紅素的DMEM 處理)、1.5 μmol/L Cel 組(用含有1.5 μmol/L 雷公藤紅素的DMEM 處理)、2.0 μmol/L Cel 組(用含有2.0 μmol/L 雷公藤紅素的DMEM 處理),各6 株。

1.3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)活力的測(cè)定 分組的細(xì)胞接種在96 孔培養(yǎng)板內(nèi),用不同條件處理24 h 后在每個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入20 μl MTS 試劑盒檢測(cè)液,在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,取出培養(yǎng)板并震蕩,而后在酶標(biāo)儀上讀取450 nm波長(zhǎng)處的吸光值,以吸光值作為細(xì)胞生長(zhǎng)活力值。

1.3.3 基因mRNA 表達(dá)水平的測(cè)定 分組的細(xì)胞接種在6 孔培養(yǎng)板內(nèi),用不同條件處理24 h 后棄去培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液,用超純RNA 提取試劑盒分離得到細(xì)胞內(nèi)的RNA,用SuperRTcDNA 第一鏈合成試劑盒將細(xì)胞內(nèi)的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用UltraSYBR Mixture試劑盒對(duì)基因cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin、p16、PTEN、GSK-3β、Bax、FASL、FAS、Caspase-3、Bcl-2、Livin、Survivin 進(jìn)行擴(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增曲線計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞生長(zhǎng)活力比較 空白對(duì)照組及0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組的細(xì)胞生長(zhǎng)活力分別為(1.36±0.22)、(1.02±0.16)、(0.83±0.16)、(0.70±0.09)、(0.56±0.08),0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組的細(xì)胞生長(zhǎng)活力均明顯低于空白對(duì)照組,2.0 μmol/L Cel 組的細(xì)胞生長(zhǎng)活力均明顯低于0.5、1.0、1.5 μmol/L Cel 組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組促增殖基因表達(dá)及增殖抑制基因表達(dá)水平比較 0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組中cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin 的mRNA 表達(dá)水平均明顯低于空白對(duì)照組,p16、PTEN、GSK-3β 的mRNA 表達(dá)水平均明顯高于空白對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組 中cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin 的mRNA 表達(dá)水平均呈降低趨勢(shì),p16、PTEN、GSK-3β 的mRNA 表達(dá)水平均呈升高趨勢(shì),各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1,表2。

2.3 各組促凋亡基因表達(dá)及凋亡抑制基因表達(dá)水平比較 0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組中Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的mRNA 表達(dá)水平均明顯高于空白對(duì)照組,Bcl-2、Livin、Survivin 的mRNA 表達(dá)水平均明顯低于空白對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L Cel 組中Bcl-2、Livin、Survivinn的mRNA 表達(dá)水平均呈降低趨勢(shì),Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的mRNA 表達(dá)水平均呈升高趨勢(shì),各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3,表4。

表1 各組促增殖基因表達(dá)水平比較()

表1 各組促增殖基因表達(dá)水平比較()

注：與空白對(duì)照組比較,aP＜0.05；與0.5 μmol/L Cel 組比較,bP＜0.05；與1.0 μmol/L Cel 組比較,cP＜0.05；與1.5 μmol/L Cel組比較,dP＜0.05

表2 各組增殖抑制基因表達(dá)水平比較()

表2 各組增殖抑制基因表達(dá)水平比較()

注：與空白對(duì)照組比較,aP＜0.05；與0.5 μmol/LCel 組比較,bP＜0.05；與1.0 μmol/L Cel 組比較,cP＜0.05；與1.5 μmol/L Cel組比較,dP＜0.05

表3 各組促凋亡基因表達(dá)水平比較()

表3 各組促凋亡基因表達(dá)水平比較()

注：與空白對(duì)照組比較,aP＜0.05；與0.5 μmol/LCel 組比較,bP＜0.05；與1.0 μmol/L Cel 組比較,cP＜0.05；與1.5 μmol/L Cel組比較,dP＜0.05

表4 各組凋亡抑制基因表達(dá)水平比較()

表4 各組凋亡抑制基因表達(dá)水平比較()

注：與空白對(duì)照組比較,aP＜0.05；與0.5 μmol/LCel 組比較,bP＜0.05；與1.0 μmol/L Cel 組比較,cP＜0.05；與1.5 μmol/L Cel組比較,dP＜0.05

3 討論

胃癌的發(fā)病率高,但預(yù)后不良,5 年生存率低,手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后輔助化療能夠使患者的生存時(shí)間延長(zhǎng),但整體療效仍有極大改進(jìn)空間。近年來(lái),中藥的抗腫瘤作用受到了越來(lái)越多的關(guān)注,雷公藤紅素是在中藥雷公藤中提取得到的抗腫瘤活性成分,已經(jīng)在卵巢癌、結(jié)腸癌相關(guān)的細(xì)胞研究中被證實(shí)能夠抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［4,5］。為了明確雷公藤紅素用于胃癌治療的價(jià)值,本研究離體培養(yǎng)了胃癌BGC823 細(xì)胞株,并用不同劑量的雷公藤紅素進(jìn)行處理,分析雷公藤紅素處理后的細(xì)胞生長(zhǎng)活力,提示：不同劑量雷公藤紅素處理后細(xì)胞的生長(zhǎng)活力均明顯下降,且雷公藤紅素的劑量越大,生長(zhǎng)活力受抑制越明顯。這一結(jié)果表明雷公藤紅素對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用,進(jìn)而提示雷公藤紅素具有治療胃癌的潛在價(jià)值。

癌細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程與細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān),當(dāng)增殖基因、凋亡基因表達(dá)發(fā)生改變時(shí),細(xì)胞增殖和凋亡行為發(fā)生相應(yīng)變化并對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。胃癌病灶內(nèi)與癌細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的基因變化包括促增殖基因cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin 及凋亡抑制基因Bcl-2、Livin、Survivin 的高表達(dá)［6-8］,增殖抑制基因p16、PTEN、GSK-3β 及促凋亡基因Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的低表達(dá)［9,10］,上述基因已經(jīng)被證實(shí)在胃癌病灶內(nèi)發(fā)生了相應(yīng)的變化。在明確雷公藤紅素對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用后,本研究進(jìn)一步分析了雷公藤紅素對(duì)胃癌細(xì)胞內(nèi)增殖基因、凋亡基因的調(diào)節(jié)作用,旨在明確雷公藤紅素發(fā)揮生長(zhǎng)抑制作用的分子機(jī)制。

促增殖基因和增殖抑制基因通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖來(lái)影響細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程。促增殖基因cyclinD1 的編碼產(chǎn)物能夠與相應(yīng)激酶結(jié)合并促進(jìn)細(xì)胞周期發(fā)展,有利于增強(qiáng)細(xì)胞的生長(zhǎng)活力；PI3K、mTOR、β-catenin 是cyclinD1 上游的調(diào)節(jié)基因,PI3K 活化后能夠使mTOR激活、Wnt 通路活化,則能使β-catenin 激活,mTOR和β-catenin 激活后能夠進(jìn)入細(xì)胞核并啟動(dòng)cyclinD1的表達(dá)。增殖抑制基因p16 能夠直接拮抗cyclinD1的活力并阻礙細(xì)胞周期,降低細(xì)胞生長(zhǎng)活力；PTEN和GSK-3β 分別拮抗PI3K 及β-catenin,PTEN 能夠使PI3K 發(fā)生去磷酸化并阻礙由其介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng),GSK-3β 能夠水解β-catenin 并阻礙由其介導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究對(duì)增殖基因的分析發(fā)現(xiàn)：不同劑量雷公藤紅素處理后細(xì)胞中cyclinD1、PI3K、mTOR、β-catenin的mRNA 表達(dá)水平降低,p16、PTEN、GSK-3β 的mRNA 表達(dá)水平均增加,且雷公藤紅素劑量越大,基因表達(dá)的趨勢(shì)越明顯。這一結(jié)果表明雷公藤紅素能夠使胃癌細(xì)胞中促增殖基因表達(dá)減少、增殖抑制基因表達(dá)增加,進(jìn)而通過(guò)增殖抑制活性來(lái)起到生長(zhǎng)抑制作用。

促凋亡基因和凋亡抑制基因通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡來(lái)影響細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程。Caspase-3 是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行分子,上游線粒體途徑和死亡受體途徑能夠通過(guò)Caspase-7、Caspase-8 及Caspase-9 來(lái)使Caspase-3 發(fā)生活化,進(jìn)而直接引起細(xì)胞凋亡；Bax是線粒體凋亡途徑的促進(jìn)分子,FAS/FASL 則是死亡受體凋亡途徑的促進(jìn)分子,通過(guò)介導(dǎo)促凋亡活性來(lái)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。Bcl-2、Livin、Survivin是細(xì)胞凋亡的抑制分子,Bcl-2 通過(guò)拮抗Bax 來(lái)起到凋亡抑制作用,Livin、Survivin 則直接通過(guò)拮抗多種Caspase 的激活來(lái)抑制凋亡。本研究對(duì)凋亡基因的分析發(fā)現(xiàn)：不同劑量雷公藤紅素處理后細(xì)胞中Bax、FASL、FAS、Caspase-3 的mRNA 表達(dá)水平增加,Bcl-2、Livin、Survivin 的mRNA 表達(dá)水平均減少,且雷公藤紅素劑量越大,基因表達(dá)的趨勢(shì)越明顯。這一結(jié)果表明雷公藤紅素能夠使胃癌細(xì)胞中促凋亡基因表達(dá)增加、凋亡抑制基因表達(dá)減少,進(jìn)而通過(guò)促凋亡活性來(lái)起到生長(zhǎng)抑制作用。

綜上所述,雷公藤紅素對(duì)胃癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)活力具有抑制作用,調(diào)節(jié)增殖及凋亡基因表達(dá)是雷公藤紅素發(fā)揮生長(zhǎng)抑制作用的分子機(jī)制。本研究的結(jié)論均來(lái)自細(xì)胞實(shí)驗(yàn),今后可進(jìn)一步在荷瘤鼠模型中驗(yàn)證雷公藤紅素對(duì)胃癌病灶生長(zhǎng)的抑制作用。