豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性及其對巨噬細胞胞外誘捕網形成的影響

李 琦，牛俊輝，王曉利，毛 靜，全映穎， 劉桂坤，雷顯前，朱鵬瑤，廖成水*

(1. 河南科技大學 動物科技學院/洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點 實驗室，洛陽 471023；2. 河南科技大學 基礎醫學院，洛陽 471023)

豬霍亂沙門菌(SalmonellaCholeraesuis)是一種廣泛存在于自然界中的革蘭陰性兼性厭氧菌，是引起仔豬副傷寒的主要病原菌[1]。同時，豬霍亂沙門菌亦可造成人類腸道外感染[2]。沙門菌、大腸桿菌、單增李斯特菌和金黃色葡萄球菌等屬于常見的食源性病原菌。腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌是人和動物沙門菌病的主要血清型[3]，但豬霍亂沙門菌作為一種人獸共患致病菌引發的公共衛生安全問題仍不可被忽視[4-5]。細菌分泌的胞外產物在細菌與宿主互用過程中起著關鍵性作用，胞外產物有助于豬霍亂沙門菌侵襲宿主細胞，并在吞噬細胞內復制和增殖，從而導致人類和豬群產生炎癥、高燒和腹瀉等癥狀[6]。

核酸酶廣泛存在于各種微生物胞外產物中，在微生物感染和宿主免疫中發揮著重要作用[7]。胞外核酸酶可以分解外源DNA作為微生物生存的營養物質并且保護自身結構不被破壞[8]。胞外核酸酶可以作為毒力因子在細菌侵入宿主機體時發揮作用[9]。大量的外源DNA能使宿主細胞表面的黏性分泌物增多，而胞外核酸酶可局部降解這些分泌物，從而導致細菌更容易附著在隱藏的細胞表面，有助于細菌成功感染宿主[10]。探究細菌胞外產物有助于揭示病原體的致病機制，但目前未見關于豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的報道。

胞外誘捕網(extracellular traps，ETs)是新發現的一種由DNA和顆粒蛋白組成的固有免疫防御機制[11]，ETs廣泛存在于中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞和巨噬細胞/單核細胞，在體內外可捕獲和殺滅細菌、病毒、真菌和寄生蟲等絕大多數病原[12]。構成ETs的主骨架是DNA，因此，DNA酶可降解這種結構物質。豬霍亂沙門菌胞外產物是否可降解ETs值得探究。為此，本研究通過平板培養法、瓊脂糖凝膠電泳法和瓊脂擴散法觀察豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性，同時分析不同溫度、pH和金屬離子對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響以及豬霍亂沙門菌胞外產物對巨噬細胞胞外誘捕網(macrophage extracellular traps，METs)形成的影響，為豬霍亂沙門菌胞外產物在致病性和免疫逃避方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞系

豬霍亂沙門菌C78-1株、白色念珠菌ATCC 10231株和小鼠巨噬細胞細胞系J774A.1由洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

10×Loading Buffer購自日本TaKaRa公司；瓊脂糖、瓊脂粉、核酸染料Goodview、氯化鈉和葡萄糖等購自北京索萊寶科技有限公司；DNase I(1 000 U) 和10×DNase I Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司；胰蛋白胨、酵母浸出物等購自英國OXOID公司；λDNA、BCA蛋白質定量分析試劑盒、胰蛋白酶、谷氨酰胺、青霉素和硫酸鏈霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司；高糖DMEM培養基和胎牛血清購自Hyclone公司；Hoechst 33342和Sytox Green購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 豬霍亂沙門菌的復蘇及其胞外產物的收集

將-80 ℃保存的豬霍亂沙門菌C78-1株于LB固體平板進行復蘇，然后挑取單個菌落于LB液體培養基中，37 ℃ 180 r·min-1震蕩培養12～16 h。將培養液按1∶10比例接種于新鮮LB液體培養基，37 ℃ 180 r·min-1繼續培養6 h后離心法收集上清液。然后用透析袋多次透析收集胞外產物，經BCA蛋白質定量分析試劑盒測定蛋白濃度后備用。

1.4 平板培養法觀察豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性

用50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)配制1.0% LB固體培養基，在倒板前添加終濃度分別為50 μg·mL-1的λDNA和1 μg·mL-1的核酸染料。用PBS稀釋新鮮培養的豬霍亂沙門菌，然后均勻涂布于LB固體平板上，37 ℃溫箱培養24 h，在凝膠成像系統下觀察豬霍亂沙門菌單個菌落周圍的λDNA是否被降解。

1.5 瓊脂擴散法觀察豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性

常規配制1.0%瓊脂平板，添加λDNA和核酸染料Goodview使得終濃度分別達到50 μg·mL-1和1 μg·mL-1。利用打孔器在瓊脂平板上打若干個直徑為5 mm的孔，封底后，分別添加胞外產物(5 μg·mL-1)、 DNase I(10 U)和LB液體培養基，37 ℃濕盒孵育24 h，在凝膠成像系統下觀察孔周圍的λDNA是否被降解。

1.6 瓊脂糖凝膠電泳法觀察豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性

酶切體系(50 μL)：50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)5 μL、λDNA(0.1 mg·mL-1)1 μL、豬霍亂沙門菌胞外產物(5 μg·mL-1)5 μL，補充ddH2O至總體積為50 μL，于37 ℃水浴鍋中進行酶切反應，孵育20 min，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切情況。

1.7 不同溫度對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響

按照“瓊脂糖凝膠電泳法測定豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性”的方法觀察溫度對豬霍亂沙門菌胞外產物(5 μg·mL-1)降解λDNA的影響，溫度設置16、25、30、37、42、50和60 ℃。同時，為觀察胞外產物核酸酶的耐熱性，胞外產物(5 μg·mL-1)分別經65、70、75和80 ℃預處理20 min，然后按上文所述方法分析酶切變化情況。

1.8 不同pH對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響

按照“瓊脂糖凝膠電泳法測定豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性”的方法觀察溫度對豬霍亂沙門菌胞外產物(5 μg·mL-1)降解λDNA的影響，反應緩沖液的pH設置4.0(甲苯酸鹽緩沖液)、5.0(醋酸鹽緩沖液)、6.0(檸檬酸鹽緩沖液)、7.0(磷酸鹽緩沖液)、8.0(Tris緩沖液)、9.0(硼酸鹽緩沖液)、10.0(甘氨酸緩沖液)和11.0(甲胺緩沖液)，其他參數不變，然后按上文所述方法分析酶切變化情況。

1.9 不同金屬離子對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響

按照“瓊脂糖凝膠電泳法測定豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性”的方法觀察金屬離子對豬霍亂沙門菌胞外產物(5 μg·mL-1)降解λDNA的影響，金屬離子設置Na+、K+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Fe3+，使得反應體系中金屬離子的終濃度分別為0.01、0.10、1.00、5.00和10.00 mmol·L-1， 其他參數不變，然后按上文所述方法分析酶切變化情況。

1.10 豬霍亂沙門菌胞外產物對白色念珠菌刺激巨噬細胞METs形成的影響

常規方法復蘇巨噬細胞J774A.10，取24孔細胞培養板按1×105個·孔-1加入巨噬細胞，孵育1 h 后加入新鮮培養好的白色念珠菌1×105CFU，培養基為不含胎牛血清和雙抗的DMEM，于5% CO237 ℃ 孵育2 h。然后加入胞外產物(5 μg·mL-1)、熱滅活胞外產物或DNase I。37 ℃孵育10 min后，輕輕去除上清液，加入Hoechst 33342和Sytox Green(5 μmol·L-1) 染料孵育5 min，利用熒光顯微鏡觀察METs形成的情況。同時，為了定量分析胞外誘捕網形成情況，按照同樣的試驗條件和方法進行巨噬細胞和白色念珠菌共孵育，培養基為不含胎牛血清和雙抗的無酚紅DMEM培養基。孵育結束后，加入Sytox Green(5 μmol·L-1)染料，于5% CO237 ℃ 作用5 min后，檢測METs的形成。以巨噬細胞空白對照組的熒光水平為1，從而分析各組METs形成的情況。在兩個試驗中均設置豬霍亂沙門菌單獨感染巨噬細胞的對照研究。

2 結 果

2.1 平板培養法觀察豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性

λDNA被核酸染料Goodview染色后在紫外線下觀察時顏色呈灰白色(圖1C)，而不含λDNA或者λDNA被降解后，在紫外線下觀察時顏色呈黑色(圖1A)。因此，當LB固體瓊脂中均勻混合了λDNA，在紫外燈下觀察時瓊脂顏色呈灰白色，而如瓊脂上生長的細菌分泌核酸酶，細菌周圍瓊脂中的λDNA可被降解，經核酸染料Goodview染色后紫外線下觀察顯示菌落周圍瓊脂表現為黑色。在本試驗中，將新鮮培養的豬霍亂沙門菌均勻涂布于含有λDNA和核酸染料的LB固體平板上，37 ℃溫箱培養24 h后，凝膠成像系統觀察結果顯示，在紫外燈下豬霍亂沙門菌菌落周圍瓊脂顯示出一圈黑色區域(圖1B)，表明菌落周圍瓊脂中的λDNA已被降解，提示豬霍亂沙門菌生長過程中可分泌具有核酸酶活性的胞外產物。

A.不含λDNA陰性對照組；B. 豬霍亂沙門菌組；C. 含λDNA陽性對照組。白色箭頭所指黑色區域為λDNA被降解區域 A. Negative control without λDNA; B. The extracellular products from S. Choleraesuis; C. Positive control with λDNA. The white arrow represents λDNA digestion around colony圖1 平板培養法測定豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性Fig.1 Detection of the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis by agar culture assay

2.2 瓊脂擴散法測定豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性

為單獨分析豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性，收集豬霍亂沙門菌胞外產物加到含有λDNA和核酸染料的瓊脂平板孔中，如胞外產物具有核酸酶活性，在紫外線下就可顯示瓊脂孔周圍的λDNA被降解。凝膠成像系統觀察結果顯示，37 ℃濕盒孵育24 h后，LB培養基陰性對照孔在紫外燈照射下周圍未出現顏色變化，而DNase I陽性對照孔周圍出現黑色環狀區域，胞外產物也出現相似的情況(圖2)，說明豬霍亂沙門菌分泌的胞外產物具有降解λDNA的活性。

A. DNase I；B. 豬霍亂沙門菌胞外產物；C. LB培養基對照 A. DNase I; B. The extracellular products from S. Choleraesuis; C. LB control圖2 瓊脂擴散法檢測豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性Fig.2 Detection of the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis by agar diffusion method

2.3 瓊脂糖凝膠電泳法觀察豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性

為進一步分析豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性，收集豬霍亂沙門菌胞外產物與λDNA共孵育，瓊脂糖凝膠電泳可觀察λDNA降解情況。凝膠成像系統觀察結果顯示，LB液體培養基陰性對照組未顯示出降解λDNA的能力，DNase I陽性對照組λDNA全部被降解，1 μg·mL-1胞外產物即表現出降解λDNA的能力，并隨著胞外產物濃度增加，λDNA逐漸被降解，并且在5 μg·mL-1時λDNA可被完全降解(圖3)。結果進一步證實了豬霍亂沙門菌胞外產物具有核酸酶活性。

1.λDNA；2.DNase I + λDNA；3.LB + λDNA；4～8. 1、2、3、4 和5 μg·mL-1胞外產物 1. λDNA; 2. DNase I + λDNA; 3. LB + λDNA. 4-8. The extracellular products from S. Choleraesuis with 1, 2, 3, 4, and 5 μg·mL-1, respectively圖3 瓊脂糖凝膠電泳法測定豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性Fig.3 Detection of the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis by agarose gel electrophoresis

2.4 不同溫度對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響

為研究不同溫度對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響，在16、25、30、37、42、50和60 ℃下進行酶切反應。結果顯示，反應溫度為16 ℃時胞外產

物降解λDNA的活性較弱，隨著孵育溫度增高，降解λDNA活性也逐漸增強，且反應溫度達到42 ℃時表現出最強的核酸酶活性，但溫度繼續升高后(50和60 ℃)胞外產物核酸酶的活性被抑制(圖4A)。同時，胞外產物的耐熱性較差，經65 ℃以上溫度處理后核酸酶活性被完全抑制(圖4B)。

2.5 不同pH對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響

為研究不同pH對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響，在pH 4.0～11.0條件下進行酶切反應。結果顯示，反應pH為4.0和5.0時胞外產物表現出較弱的核酸酶活性，隨著反應pH增高，降解λDNA活性也逐漸增強，且pH達到9.0時表現出最強的核酸酶活性，但pH繼續升高后(pH 10.0和11.0)胞外產物核酸酶的活性被抑制(圖5)。

2.6 不同金屬離子對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響

為研究金屬離子對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響，酶切反應中添加濃度為0.01、0.10、1.00、5.00和10.00 mmol·L-1的Na+、K+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+和Fe3+。結果顯示，Na+、K+、Ca2+和Ni2+對胞外產物的核酸酶活性沒有影響，高濃度(5.00～10.00 mmol·L-1)的Ba2+、Mg2+和Mn2+可提高胞外產物切割λDNA的活性，低濃度無影響；低濃度(0.01～1.00 mmol·L-1)的Zn2+、Cu2+和Fe3+促進胞外產物切割λDNA的活性，高濃度無影響；相反地，低濃度(0.01～1.00 mmol·L-1) Co2+則抑制胞外產物切割λDNA的活性(圖6)，提示不同金屬離子對豬霍亂沙門菌胞外產物切割核酸酶活性的影響存在差異。

A. 胞外產物在不同孵育溫度下的核酸酶活性(1. λDNA；2～8. 分別代表反應溫度為16、25、30、37、42、50和60 ℃)；B.胞外產物在高溫條件下的熱穩定性(1～4.分別代表溫度為65、70、75和80 ℃) A. The nuclease activity of the extracellular products was measured at different temperature (1. λDNA; 2-8. Represent 16, 25, 30, 37, 42, 50 and 60 ℃, respectively); B. The heat stability of the extracellular products (1-4. Represent 65, 70, 75 and 80 ℃, respectively)圖4 溫度對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis

1.λDNA；2～9.分別代表pH在4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0下檢測胞外產物活性 1. λDNA; 2-9. Represent pH 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 and 11.0, respectively圖5 pH對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響Fig.5 Effect of pH on the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis

2.7 豬霍亂沙門菌胞外產物對白色念珠菌刺激巨噬細胞METs形成的影響

將巨噬細胞J774A.1與白色念珠菌ATCC 10231共孵育，經Hoechst 33342染色后用熒光顯微鏡觀察。結果顯示，白色念珠菌可誘導巨噬細胞產生明顯的胞外DNA的纖維狀結構(圖7B)，而未與白色念珠菌共孵育的細胞未見這種結構物質(圖7A)。當往白色念珠菌誘導的胞外誘捕網加入5 μg·mL-1豬霍亂沙門菌胞外產物后，胞外DNA的纖維狀結構物質明顯減少(圖7C)，這種現象與DNase I陽性處理組的結果相似(圖7D)，但經熱滅活處理的豬霍亂沙門菌胞外產物組未見這種現象(圖7E)，說明豬霍亂沙門菌胞外產物可抑制白色念珠菌誘導的胞外誘捕網。同時，還發現豬霍亂沙門菌單獨與巨噬細胞共孵育時并不能刺激釋放METs(圖7F)。同樣地，熒光酶標儀定量結果顯示，白色念珠菌刺激巨噬細胞產生的熒光強度是未處理組的65倍左右，而加入豬霍亂沙門菌胞外產物，白色念珠菌誘導的胞外DNA含量顯著減少，約減少至未處理組的25倍左右，這與熒光顯微鏡觀察得到的結果一致(圖8)(P<0.01)。

各圖中離子濃度分別為0、0.01、0.10、1.00、5.00、10.00 mmol·L-1 The ion concentrations in the figures are 0,0.01,0.10,1.00,5.00 and 10.00 mmol·L-1, respectively圖6 金屬陽離子對豬霍亂沙門菌胞外產物核酸酶活性的影響Fig.6 Effect of metal ions on the nuclease activity of the extracellular products from S. Choleraesuis

A.空白對照組；B.白色念珠菌組；C.白色念珠菌+胞外產物組；D.白色念珠菌+DNase I組；E.白色念珠菌+熱滅活胞外產物組；F.豬霍亂沙門菌組。白色箭頭所指為METs A. Control; B. Candida albicans; C. Candida albicans + the extracellular products; D. Candida albicans + DNase I; E. Candida albicans + the heat inactivated-extracellular products; F. S. Choleraesuis. The white arrow represents METs圖7 熒光顯微鏡觀察豬霍亂沙門菌胞外產物對白色念珠菌刺激METs形成的影響Fig.7 Effect of the extracellular products from S. Choleraesuis on METs induced by Candida albicans under fluorescence microscope

**.P<0.01圖8 定量分析豬霍亂沙門菌胞外產物對白色念珠菌刺激METs形成的影響Fig.8 Quantification of effect of the extracellular products on METs induced by Candida albicans

3 討 論

核酸酶主要參與機體的營養代謝、遺傳物質的復制、重組和修復機制以及病原感染和免疫等生理和病理過程[13]。具有核酸酶活性的胞外產物對于細菌進入非吞噬細胞或在吞噬細胞中存活和增殖是必需的[14]。胞外核酸酶在細菌生物被膜形成過程中降解胞外DNA以提供自身的營養物質，如MR-1胞外核酸酶[15]。沙門菌基因組分析發現具有編碼核酸酶的基因，但豬霍亂沙門菌胞外產物的確切核酸酶活性卻未見報道。本研究通過平板培養法、瓊脂糖凝膠電泳法和瓊脂擴散法均證實了豬霍亂沙門菌分泌的胞外產物具有降解λDNA的核酸酶活性。

本研究利用瓊脂糖凝膠電泳法觀察了溫度、pH和金屬離子對豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性的影響。微生物分泌的核酸酶在較寬的pH范圍(pH 6.0～10.0)可發揮活性，且一般情況下在pH 8.0～8.5的條件下活性最高[16]。豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性在pH 4.0～6.0的酸性條件下胞外產物的核酸酶活性較弱，在pH為9.0的堿性條件下活性最強。35～44 ℃是絕大多數微生物核酸酶表現出活性的最佳溫度[16]。本研究發現，豬霍亂沙門菌胞外產物在42 ℃時表現出較好的核酸酶活性。同時，多數核酸酶經70 ℃作用30 min后活性可被滅活[17]，而豬霍亂沙門菌胞外產物在溫度高于60 ℃時核酸酶活性降低，這有可能是溫度的升高造成了酶蛋白或者酶核酸發生了變性。金屬離子對胞外產物的核酸酶活性具有多重影響[18]。Dunn[19]對大腸桿菌核酸酶活性的研究表明，大腸桿菌核酸酶是依賴二價金屬離子的核酸酶。本研究結果發現，5.00～10.00 mmol·L-1Ba2+、Mg2+和Mn2+可提高豬霍亂胞外產物切割λDNA的活性；0.01～1.00 mmol·L-1的Zn2+、Cu2+和Fe3+促進胞外產物切割λDNA的活性。雖然本研究初步證實了豬霍亂沙門菌胞外產物的核酸酶活性，但從核酸酶的部分酶學特性來看，豬霍亂沙門菌分泌的胞外產物可能含有多種核酸酶。

研究證實病原微生物通過分泌胞外核酸酶降解固有免疫細胞ETs的DNA骨架是逃避免疫殺傷的主要途徑之一[21]。霍亂弧菌、鏈球菌屬和金黃色葡萄球菌等病原菌的胞外核酸酶具有促進降解中性粒細胞ETs從而逃避中性粒細胞ETs捕獲的能力[20-22]。本研究證實豬霍亂沙門菌胞外產物具有核酸酶活性，我們之前的研究發現白色念珠菌可刺激巨噬細胞釋放ETs[23]，而豬霍亂沙門菌胞外產物可降解這種胞外網狀結構。同時豬霍亂沙門菌并不能刺激巨噬細胞釋放METs，推測豬霍亂沙門菌胞外產物可能與細菌免疫逃避有關。因此，分離和鑒定豬霍亂沙門菌胞外核酸酶的種類與特性以及分析豬霍亂沙門菌胞外核酸酶在感染和宿主免疫中的確切作用是我們下一步重點研究的方向。

4 結 論

豬霍亂沙門菌分泌的胞外產物具有降解λDNA的核酸酶活性，胞外產物可顯著降解白色念珠菌刺激巨噬細胞形成的胞外誘捕網。