新疆部分地區馬皰疹病毒1型感染的血清學調查

胡 月，高雁怩，加爾肯，車傳忠，王旭蕾，姜 平，冉多良*，劉建華

(1.新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052；2. 南京農業大學動物醫學學院，南京 210095)

馬皰疹病毒1型(equine herpesvirus-1， EHV-1)和4型(equine herpesvirus-4， EHV-4)是馬鼻肺炎(equine rhinopneumonitis，ER)的病原體，這兩種病毒均能引起馬屬動物呼吸系統疾病[1]。然而，EHV-1除了可以引起馬匹呼吸系統疾病以外，還能導致孕馬流產和新生馬駒死亡及神經系統疾病，如馬皰疹病毒髓腦病(equine herpesvirus myeloencephalopathy，EHM)，且其所致疾病的病發率和死亡率均較EHV-4高[2-3]。由于EHV-1是一種引起馬匹不同臨床綜合征的病原體，給馬產業造成嚴重的經濟損失，2012年5月，世界衛生組織將EHV-1引起的疾病稱為馬皰疹病毒-1型感染(infection with equine herpesvirus-1)[4]，2020年7月，我國農業農村部、海關總署將該病列為二類動物傳染病[5]。

然而，長期以來，我國的流行病學的研究重心一直放在馬鼻肺炎病的調查與防控上，忽略了區分EHV-1與EHV-4感染[6-8]。2013—2017年，針對新疆地區的馬鼻肺炎的流行病學調查顯示各地區平均陽性率為15.16%～28.85%[9-13]。ER在新疆廣泛流行，但卻沒有針對EHV-1開展的流行病學調查，對EHV-1的防控工作帶來阻礙。為掌握新疆地區EHV-1的流行現狀，本研究于2019—2020年研究采集新疆不同地區代表性馬場的1 657份馬血清樣品，利用已建立的針對EHV-1 gG蛋白抗體的間接ELISA檢測方法[14]，進行了血清學調查，并分析其流行特點和感染因素，為新疆馬皰疹病毒1型感染的有效防控提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本

2019年6月—2020年7月，由新疆農業大學動物醫學學院和部分地區獸醫站從新疆烏魯木齊、伊犁州、昌吉州和巴州的16處規模化養殖場采集純血馬、混血馬、哈薩克馬、伊犁馬、焉耆馬、普氏野馬共1 657份血液樣本，分批離心制備血清，于-80 ℃保存后集中檢測。

1.2 試劑及儀器

TMB顯色液和DAB試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；ELISA酶標板購自康為世紀公司；兔抗馬IgG-HRP購自Abcam公司；其他常規試劑均為國產分析純。酶標分析儀(Elx800)購自Bio-tek公司。

1.3 菌種、質粒及抗體

表達EHV-1 gG蛋白的陽性質粒pGEX-4T-1-gG，感受態表達菌E.coliBL21(DE3)，EHV-1感染馬陽性血清、陰性血清均由新疆農業大學動物醫學學院傳染病實驗室保存。

1.4 檢測方法

將含有pGEX-4T-1-gG的陽性菌大量誘導表達后，用GSTrapTM HP kits純化EHV-1 gG蛋白，并測定蛋白濃度。按照實驗室已建立的間接ELISA方法進行樣品檢測，反應條件：抗原蛋白包被濃度為0.5 μg·mL-1；4 ℃過夜；50 g·L-1脫脂奶粉封閉，37 ℃ 2 h；待檢血清1∶800稀釋，37 ℃ 1 h； 二抗1∶1 000稀釋，37 ℃ 30 min；加TMB顯色液，37 ℃ 5 min；加1 mol·L-1H2SO4終止。每個樣品同時設置3個平行對照，設陰陽對照。結果判定，樣品OD450 nm值>0.307可判為陽性，OD450 nm值≤0.307可判為陰性。

1.5 數據統計與分析

運用SPSS 20.0進行統計分析，對不同品種、性別及年齡的馬匹EHV-1感染陽性率采用卡方檢測。

2 結 果

2.1 不同地區馬血清馬皰疹病毒1型感染抗體檢測

來自16處規模化養殖場的1 657份血液樣本含有544份陽性樣品，平均陽性率為32.28%。烏魯木齊7處規模化養殖場平均陽性率為39.34%(297/755)；伊犁州7處規模化場平均陽性率為22.56%(155/687)；昌吉州1處規模化養殖場陽性率為90.52%(86/95)；巴州1處規模化養殖場陽性率為5.00%(6/120)(表1)。其中，昌吉州某養殖場陽性率最高，烏魯木齊次之，與伊犁州和巴州相比差異顯著(P<0.05)。烏魯木齊養殖場感染EHV-1存在城郊差異，縣郊養殖場(烏魯木齊縣、達坂城區)44.05%(270/613)與烏魯木齊市區養殖場(高新區、國有馬場)19.01%(27/142)抗體陽性率差異顯著(P<0.05)。伊犁州的不同鄉鎮的養殖場感染EHV-1存在差異，昭蘇縣阿克達拉鎮陽性率最高，達48.28%(28/58)，尼勒克縣陽性率最低，僅為0.9%(2/222)。表明EHV-1感染在新疆馬群中存在地區差異。

表1 馬血清來源及其EHV-1抗體檢測結果

2.2 不同品種馬血清EHV-1抗體檢測

純血馬、混血馬、哈薩克馬、伊犁馬、焉耆馬、普氏野馬的EHV-1抗體陽性率分別為20.34%、32.93%、44.92%、19.35%、5.00%、90.52%。其中，普氏野馬血清的EHV-1抗體陽性率最高，顯著高于其他品種的馬(P<0.05)。焉耆馬血清的EHV-1抗體陽性率最低，顯著低于其他品種的馬(P<0.05)(圖1)。本土品種(哈薩克馬、伊犁馬、焉耆馬)平均抗體陽性率為31.70%(305/962)，與引進品種(純血馬、混血馬)25.50%(153/600)差異顯著(P<0.05)；普氏野馬90.52%(86/95)與家馬29.32%(458/1562)的抗體陽性率差異顯著(表2)。通過血清學檢測初步表明不同品種馬匹EHV-1抗體陽性率差異顯著。

圖1 不同品種馬血清馬皰疹病毒1型抗體檢測結果Fig.1 The detection result of horse EHV-1 antibody in different breeds

2.3 不同性別、年齡馬血清EHV-1抗體檢測

統計(表2)表明，母馬感染EHV-1的抗體陽性率為38.84%(414/1 066)顯著高于公馬22.00%(130/591)(P<0.05)，馬匹感染EHV-1存在性別差異。16處規模化養殖場飼養的馬匹年齡為0～15歲，可分為幼年(0≤Age≤1)、青年(1

3 討 論

此次EHV-1抗體陽性率檢測結果表明，2019—2020年新疆部分規模化馬場EHV-1的平均陽性率為32.28%。新疆烏魯木齊、伊犁州、昌吉州、巴州規模化養殖場普遍存在EHV-1感染，且不同地區、品種、性別及年齡的馬EHV-1感染率差異顯著(P<0.05)。其中，昌吉州某馬場飼養的普氏野馬發病率高達90.52%，該地區某養殖區于2019年5月 暴發馬皰疹病毒1型感染，圈養95匹野馬，其中，86匹野馬體溫升高至39.5～41.5 ℃，出現急性呼吸系統疾病， 6～7匹孕馬流產。2匹野馬死亡。86匹患馬經血清學檢測均為EHV-1抗體陽性，并經病毒分離鑒定確診為EHV-1感染。普氏野馬為國家一級保護動物，該物種具有6 000萬年演化史，是研究家馬起源和性狀改良的不可或缺的材料[15]。此次，新疆昌吉州暴發該病為我國普氏野馬的繁育與保護帶來了嚴重危害，制約著該物種的健康發展和保存。制定合理的免疫程序，有效控制EHV-1在新疆的流行，對該珍貴物種的保存具有重大意義[16]。

表2 不同屬性馬匹感染EHV-1血清抗體檢測結果

對烏魯木齊的調查結果顯示，縣郊養殖場抗體陽性率(44.05%)顯著高于市區養殖場(19.01%)。這與飼養環境及管理水平相關，縣郊養殖場主要飼養哈薩克馬，還包括混血馬和伊犁馬，多用于景區參觀，而市區養殖場僅飼養純血馬，用于賽馬和馬術活動。由于引進馬匹的經濟成本較高，養殖場更注重飼養環境和消毒防疫工作，因而市區馬場的飼養管理水平較縣郊馬場高[17]。此外，市區馬場間隔較遠，而縣郊馬場較為密集，不利于疫情防控[18]。提示當地應提高縣郊馬場的管理水平，降低飼養密度并做好疫苗接種工作。此次伊犁州7處規模化馬場平均陽性率為22.56%，低于2017年袁貝等[13]對伊犁州10個鄉鎮的調查結果(28.85%)。其中，伊犁州新源縣和尼勒克縣陽性率為5.96%(18/302)，低于2016年杜潤慈等[12]對兩縣的馬鼻肺炎抗體檢測結果(15.16%)。這可能與該地區EHV-4流行有關，本研究采用的EHV-1 gG蛋白抗體的間接ELISA檢測方法可以有效區分EHV-1和EHV-4感染，因此，可以準確了解EHV-1感染情況。巴州焉耆縣集中飼養的本地品種焉耆馬EHV-1感染抗體陽性率僅為5%。焉耆馬以群牧為主，因其具有持久耐勞的特性多用于馬術比賽，當地政府也重視科學飼養和防疫程序，積極開展焉耆馬養殖技術培訓班，有效控制疫病傳播[19]。

統計表明，母馬EHV-1抗體陽性率(38.84%)顯著高于公馬(22.00%)，且養殖場的母馬存欄量高于公馬，應當對母馬加強免疫預防該病。1歲以下馬匹EHV-1抗體陽性率最高，其原因是5～6月齡馬駒獲得的母源抗體逐漸減少而自身免疫力較弱，與其他年齡階段馬匹相比更易于感染EHV-1[20-21]。研究表明，4～7月齡未斷奶馬駒及時進行疫苗接種可有效預防EHV-1感染，因而養殖場應重視對幼駒的預防接種工作[21]。

本研究通過對新疆部分地區規模化養殖場馬匹的血清抗體檢測，初步了解當前新疆地區EHV-1感染的流行情況，為該病的防控提供數據支持。分析結果提示，科學的飼養管理和嚴格的防疫工作可有效控制EHV-1在馬群中的傳播，養殖場應根據不同品種的馬匹特性，給予其良好的生長環境；制定完善的免疫程序；對患馬應及時隔離與治療；加強跨區運輸馬匹EHV-1感染的監測工作。

4 結 論

通過對新疆烏魯木齊、伊犁州、昌吉州、巴州規模化養殖場進行馬皰疹病毒1型抗體檢測，發現新疆地區普遍存在EHV-1感染，且不同地區、品種、性別及年齡的馬匹EHV-1感染率差異顯著(P<0.05)，可為新疆地區EHV-1感染的研究和防控工作提供調查數據。