非洲豬瘟病毒pS273R蛋白水解酶單克隆抗體制備

張 萌，劉英楠，謝振華，敖清瑩，呂 璐， 于婉琪，金文杰，秦愛建，扈榮良，陳鴻軍*

(1.中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241； 2.軍事科學院軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所，長春 130122；3.揚州大學獸醫學院，揚州 225009)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，死亡率可高達100%[1-2]，被我國列為一類動物疫病、世界動物衛生組織(OIE)將其列為法定報告疫病。ASFV是非洲豬瘟相關病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的成員[6]。ASFV病毒粒子直徑為260～300 nm，為二十面體對稱[7]，結構復雜，不同毒株基因組全長不同，為170～194 kb，中央保守區為125 kb，基因組差異主要取決于基因組兩端可變區的多基因家族[8]。

ASFV含有151～167個開放性閱讀框(ORF)，成熟的病毒粒子中約含50種以上結構蛋白[9]。其中，由pp220水解產生的p150、p37、p34和p14和由pp62水解產生的p35、p15，均存在于成熟病毒粒子中，占結構蛋白總質量的30%[10-12]。已有研究表明：ASFV蛋白水解酶pS273R蛋白能夠識別Gly-Gly-Xaa水解位點裂解病毒多蛋白pp220和pp62，產生上述6種主要結構蛋白。pS273R編碼1個31 ku的蛋白質，包含1個“核心域”，具有SUMO-1樣蛋白酶保守的催化殘基。有研究表明,S273R蛋白酶的水解加工可以影響病毒滴度，抑制pS273R蛋白的水解過程，會導致二十面體病毒粒子的組裝缺陷[13]。因此，該蛋白酶功能研究將有助于認識ASFV復制過程。本研究通過原核表達ASFVS273R基因，制備純化抗原免疫小鼠，通過細胞融合，成功制備獲得pS273R單克隆抗體。該蛋白抗體旨在為S273R基因缺失毒株的鑒定及pS273R蛋白酶的功能研究提供生物材料。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞和實驗動物

非洲豬瘟病毒強毒株SY18株由軍事獸醫研究所保存，并在生物安全三級實驗室中在豬原代肺泡巨噬細胞(PAM)和豬原代骨髓細胞(BM)中擴增及測定感染復數；人胚腎細胞系(HEK-293T)由本實驗室保存；SPF級6～8周齡BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 質粒和主要試劑

pET-30a(+)、pCMV-2×Flag載體由本實驗室保存；高糖DMEM培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；DH5α和BL21(DE3)感受態購自美國Invitrogen公司；限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ購自英國NEB公司；T4 DNA連接酶購自美國Promega公司；Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase購自南京諾唯贊生物科技有限公司；HRP標記兔抗Flag抗體、HRP標記山羊抗鼠IgG和Alexa Fluor?488標記羊抗鼠IgG購自英濰捷基(上海)貿易有限公司；ECL顯色液購自Pierce公司；GM-CSF購自美國R&D Systems公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和IPTG購自美國Sigma公司。

1.3 S273R基因的合成與重組質粒的構建

根據ASFV SY18毒株S273R基因序列，設計特異性引物，上游為EcoRⅠ-S273R-F：5′-CCGGAATTCATGTCTATATTAGAAAAAATTAC-GTCAAGT-3′；下游為HindⅢ-S273R-R：5′-CCCAAGCTTTTATGCGATGCGAAACAGATG GGTTCTAAA-3′，以SY18病毒基因組DNA為模板，進行S273R基因擴增。PCR擴增體系50 μL：2×Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 25 μL、 上下游引物各2 μL、DNA模板50 ng，ddH2O補至50 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min； 95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33個循環；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳后回收并純化目的片段。目的片段和pET-30a(+)空載體分別經EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切，純化回收相應目的片段，T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。連接產物轉化感受態DH5α，涂布于相應LB平板，37 ℃倒置培養，菌液PCR鑒定正確后，送至上海擎科公司測序。測序正確的重組質粒按照小提質粒試劑盒說明書提取質粒，命名為pET30-S273R。定量后,于-20 ℃保存。

1.4 S273R原核表達

將原核表達質粒pET30-S273R轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，挑取單菌落接種于卡那抗性的LB液體培養基，于37 ℃搖床中以 220 r·min-1搖菌12 h后，按1∶100將菌液轉接種到1 L卡那抗性LB培養基中搖菌約4 h即OD600 nm=0.6～0.8后，分別加入終濃度為0.5和1.0 mmol·L-1IPTG，37 ℃培養6 h后，4 ℃ 12 000×g離心10 min，收集菌體沉淀。沉淀經PBS洗滌后，冰浴條件下進行超聲破碎，12 000×g離心10 min后，分別取上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析，鑒定表達情況并純化。

1.5 免疫小鼠血清抗體測定

將純化后的蛋白經BCA蛋白測定試劑盒測定濃度后，腹腔注射免疫6～8周齡BALB/c小鼠：將100 μg蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合并乳化完全，小鼠腹腔注射，首免之后隔7 d用等量不完全佐劑乳化，免疫2次，加強免疫3 d后尾靜脈采血，分離血清。利用IFA鑒定小鼠血清是否為陽性，即將ASFV SY18毒株按1 MOI感染PAM細胞24 h，用預冷的丙酮∶乙醇固定液(體積比3∶2)固定5 min， 或利用pFlag-S273R質粒轉染293T細胞24 h， 用固定液固定細胞產物。將多抗血清用PBS 1∶100稀釋，與固定的細胞于37 ℃反應45 min，PBS洗3遍；加入1∶600稀釋的Alexa Fluor?488標記羊抗鼠IgG，37 ℃反應45 min，PBS洗3遍后，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.6 抗ASFV-S273R單抗制備

選血清抗體陽性反應的小鼠進行加強免疫，72 h 后，按常規方法進行細胞融合和單抗篩選。通過有限稀釋法對檢出的陽性雜交瘤細胞進行2～3次 亞克隆，直至抗體陽性率達100%時，擴大培養并建株、保種。常規制備腹水，利用間接ELISA測定效價，并用免疫印跡(Western blot)和IFA進一步鑒定后，對腹水進行分裝，純化，置于-80 ℃凍存備用。

1.7 間接免疫熒光檢測

將pFlag-S273R質粒轉染293T細胞或用ASFV SY18毒株以1 MOI感染PAM細胞，24 h后使用預冷的固定液(丙酮、乙醇體積比3∶2)固定細胞5 min； PBS洗滌3次后，每孔加入100 μL含5%脫脂乳的PBS溶液，于37 ℃封閉1 h；PBS洗滌2次后，加入雜交瘤細胞上清，37 ℃孵育45 min；PBS洗3次，加入100 μL FITC標記的羊抗鼠IgG，于37 ℃ 避光孵育45 min，洗滌3次后，置于熒光顯微鏡下觀察結果。

1.8 間接ELISA測定抗體效價

以pS273R蛋白作為檢測抗原，通過間接ELISA法測定抗體效價。即將抗原稀釋為濃度1 ng·μL-1， 按每孔100 μL包被ELISA板，4 ℃過夜；用PBST洗3次，每孔加入100 μL PBST稀釋的5%脫脂乳封閉液，37 ℃封閉2 h；充分洗滌后，加入單抗腹水(按不同稀釋度為1∶100、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、 1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000)，每個稀釋度設置2個重復孔，以未免疫小鼠血清為陰性對照，以免疫pS273R蛋白小鼠血清為陽性對照，37 ℃ 孵育1 h，洗3次；每孔加入100 μL HRP標記山羊抗鼠IgG(1∶2 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，洗3次； 每孔加入100 μL TMB顯色液，至陰性對照顯色時，加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4終止液，用酶標儀測定OD450 nm值。

1.9 免疫印跡(Western blot)鑒定

以pFlag-S273R真核質粒轉染293T細胞，24 h后，收集蛋白樣品，或以1MOI ASFV感染PAM，不同時間點收集蛋白樣品，再以常規方法進行SDS-PAGE電泳，濕轉至硝酸纖維素膜(NC)。將NC膜用含5%脫脂乳的PBST溶液37 ℃封閉2 h，PBST洗3次，每次10 min；將小鼠多抗血清、單克隆抗體作為一抗，4 ℃孵育過夜后，PBST洗3次，每次10 min； 將HRP標記山羊抗鼠IgG 1∶5 000稀釋作為二抗，室溫孵育1 h后，PBST洗3次，利用ECL顯色液顯色，通過成像系統成像。

2 結 果

2.1 S273R基因重組質粒的構建

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在700～1 000 bp 可見單一擴增條帶，條帶大小為822 bp與預期相符。回收PCR產物，經雙酶切后，與載體質粒pET-30a(+)連接，轉化DH5α感受態細菌，挑取菌落，進行菌液PCR，鑒定后測序驗證。測序正確的重組質粒命名為pET30-S273R。

2.2 S273R蛋白的原核表達

pET30a-S273R重組質粒轉化感受態大腸桿菌BL21(DE3))。挑取陽性菌落，經兩種不同濃度IPTG誘導，設立未加IPTG誘導菌和空載體轉化菌樣本作為對照，進行SDS-PAGE電泳。結果顯示：在37 ℃誘導后，繼續培養6 h，S273R獲得高表達。通過對菌體裂解液的上清和沉淀分析發現，該蛋白主要在包涵體中表達(圖1)，蛋白大小為37 ku。

2.3 pS273R蛋白純化SDS-PAGE分析及單抗Western blot驗證

純化后的pS273R蛋白條帶較為單一，蛋白純度達90%以上，BCA法定量蛋白濃度為1.1 mg·mL-1，滿足后期免疫要求(圖2)。

1. pET30-S273R未誘導上清；2. pET30a-S273R IPTG 0.5 mmol·L-1上清；3. pET30-S273R IPTG 1.0 mmol·L-1上清；4. pET30a空載體上清；M. 預染蛋白相對分子質量標準; 5. pET30-S273R未誘導沉淀；6. pET30-S273R IPTG 0.5 mmol·L-1沉淀；7. pET30-S273R IPTG 1.0 mmol·L-1沉淀；8. pET30a空載體沉淀 1. Supernatant of pET30-S273R without induction；2. Supernatant of pET30-S273R induced with 0.5 mmol·L-1 IPTG；3. Supernatant of pET30-S273R induced with 1.0 mmol·L-1IPTG；4. Supernatant of pET30a induced with 1.0 mmol·L-1 IPTG；M. Protein marker；5. Precipitation of pET30-S273R without induction；6. Precipitation of pET30-S273R induced with 0.5 mmol·L-1 IPTG；7. Precipitation of pET30-S273R induced with 1.0 mmol·L-1 IPTG；8. Precipitation of pET30a induced with 1.0 mmol·L-1 IPTG圖1 pS273R蛋白SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of pS273R protein

2.4 抗pS273R多抗血清的檢測

為驗證多抗的特異性，將pFlag-S273R真核質粒轉染293T細胞、將SY18毒株以1 MOI感染豬肺泡巨噬細胞后分別固定，進行免疫熒光檢測。IFA結果顯示，小鼠多抗血清可特異性識別293T細胞中表達的pS273R蛋白，且在ASFV感染的豬肺泡巨噬細胞胞質呈陽性反應(圖3)。

圖2 S273R蛋白純化SDS-PAGE分析(A)及多抗血清、5A4單抗Western blot驗證(B、C)Fig.2 Expression of purified S273R protein by SDS-PAGE (A) and Western blot analysis of polyclonal sera (B) or monoclonal antibody named 5A4 (C)

A. pFlag-S273R轉染293T； B. 未轉染的293T；C. 感染24 hpi的PAM細胞；D. 未感染的PAM細胞 A. pFlag-S273R transfected 293T; B. Untransfected 293T; C. ASFV infected PAM cells for 24 h; D. Uninfected PAM cells圖3 S273R蛋白免疫熒光檢測(10×)Fig.3 Immunofluorescence assay analysis of S273R protein(10×)

2.5 pS273R單抗特性檢測

通過細胞融合，獲得4株特異性單抗。IFA結果顯示：5A4可與病毒感染和真核細胞表達產物呈陽性反應(圖4)，1C12、5A3、7B9只能與真核細胞表達產物反應。Western blot結果顯示：1C12、7B9可特異性識別ASFV病毒感染過程中產生的pS273R及真核細胞表達產物(圖5)，而5A3、5A4僅識別真核細胞表達產物的pS273R(表1)。經ELISA效價測定，4株單抗腹水效價均達1∶64 000。

圖4 5A4間接免疫熒光圖片(PAM，10×)Fig.4 5A4 identification of indirect immunofluorescence assay of MAb 5A4 (PAM，10×)

圖5 7B9特異性識別ASFV pS273RFig.5 7B9 specifically recognizes ASFV pS273R

3 討 論

ASFV pS273R是一種半胱氨酸蛋白酶，在ASFV感染過程中，該蛋白酶對ASFV多聚蛋白前體pp220和pp62進行水解，分別形成p150、p37、p34、p14和p35、p15、p8。上述蛋白組成致密的核衣殼，約占整個病毒粒子25%以上[12]。當多聚蛋白不能被蛋白酶正確切割時，新組裝的子代病毒粒子呈現錯誤包裝，易喪失傳染性[13]。

表1 ASFV pS273R單抗類型及免疫特性

從ASFV蛋白酶整體結構來看，蛋白酶pS273R主要由兩個結構域組成：N端手臂結構域(N-ter arm domain)、C端核心結構域(core domain)。pS273R蛋白酶的N端手臂結構域是一個新結構域，且該結構域對維持蛋白酶活性具有至關重要的作用；C端結構域中則包含由催化三聯體Cys-His-Asn組成的核心結構域，這部分結構特征與典型半胱氨酸類蛋白酶的結構相似[14]。

本研究進行了pS273R單克隆抗體制備并成功獲得4株抗單克隆抗體，IFA結果顯示：5A4可與病毒感染和真核細胞表達產物呈陽性反應，1C12、5A3、7B9只能與真核細胞表達產物反應(圖3)。Western blot結果顯示：1C12、7B9可特異性識別ASFV病毒感染過程中產生的pS273R及真核細胞表達產物，而5A3、5A4僅識別真核細胞表達產物的pS273R(表1)。造成這一結果的差異性可能與pS273R的空間結構和蛋白翻譯后修飾有關，具體原因還需進一步分析。本試驗獲得的單抗為S273R功能研究奠定了基礎，并為基因缺失毒的鑒定提供了生物材料。

4 結 論

成功獲得ASFV S273R重組蛋白，以其制備4株單克隆抗體，并篩選出與病毒具有反應性的單克隆抗體，為ASFV S273R基因缺失毒的鑒別及S273R蛋白結構功能等基礎研究提供了重要的生物材料。