基于網絡藥理學和分子對接分析苦參堿抗PRRSV的作用機制

郝江花，孫 娜，孫盼盼，孫耀貴，范闊海，尹 偉，李宏全*

(1. 山西農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，太谷 030801；2. 山西農業(yè)大學實驗動物管理中心，太谷 030801)

苦參堿是一類生物堿，廣泛存在于多種植物的根莖中，包括北豆根、槐角、苦參、山豆根、菟絲子等[1-2]。苦參堿具有多種藥理作用，包括抗病毒[3-4]、抗炎[5-7]、抗癌[8]等。本實驗室前期研究表明，苦參堿具有抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的作用，對其典型病變間質性肺炎有明顯的治療作用。PRRS是一種急性、接觸性、高度傳染性的疾病[9]，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失[10]。PRRS的主要臨床癥狀是嚴重的呼吸道癥狀，通過組織切片觀察可見嚴重的間質性肺炎[11]。在苦參堿抗PRRSV/PCV2共感染昆明小鼠的研究中，發(fā)現(xiàn)苦參堿各劑量處理組均能不同程度地減輕病毒感染誘發(fā)的肺間隔增寬等肺病變[9]；在PRRSV/LPS共刺激小鼠建立的間質性肺炎模型中，苦參堿通過抑制白細胞的變化以及IL-1β和TNF-α的表達來改善 PRRSV/LPS共刺激誘導的間質性肺炎[12]。目前，苦參堿抗PRRSV作用機制尚未完全闡明。基于苦參堿的抗炎作用，對苦參堿抗炎作用靶點、機制的挖掘將有助于對抗PRRSV機制的深入研究。

在中國幾千年的歷史中，中藥在疾病預防和治療方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，但由于人們在其發(fā)揮療效的作用靶點及機制方面認識有限，嚴重限制了中藥的重新定位及作為新獸藥的開發(fā)利用[13-14]。網絡藥理學這一新興分支學科的興起，為中藥機制研究提供了新的技術和方法。網絡藥理學是一種以系統(tǒng)生物學和多向藥理學為理論基礎，利用生物分子網絡分析方法，在網絡數據庫查找、計算機虛擬計算以及高通量組學數據分析的基礎上構建生物信息網絡并進行網絡拓撲分析的科學研究方法[15-16]。

利用網絡藥理學，通過數據庫及在線分析平臺，構建PPI網絡，通過Degree等屬性值篩選核心靶點，并通過分子對接技術進行驗證；通過GO分析和KEGG分析尋找苦參堿潛在作用靶點的代謝通路，最終構建“藥物-靶點-通路”網絡，從整體的角度探索苦參堿的抗炎機制。通過網絡藥理學對作用靶點進行預測，為后續(xù)苦參堿抗病毒、抗炎的機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 苦參堿靶點篩選

登錄Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，通過搜索“Matrine”獲取苦參堿的化學結構，保存為sdf格式。然后將苦參堿的sdf格式文件上傳到反向藥效團匹配數據庫PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，選擇“Druggable Pharmacophore Models ”，設置匹配的靶點數目為300，點擊submit，即可得到苦參堿對應得分排名前300的靶點。得到靶點后，使用UniProt數據庫中UniProtKB搜索功能，輸入蛋白名稱，經上述數據庫檢索和轉化操作，將檢索得到的蛋白校正為其官方名稱，即Official Symbol。

1.2 抗炎靶點篩選

登錄GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)，以“Anti-inflammation”為關鍵詞進行檢索，獲取并篩選與抗炎相關的靶點數據。

1.3 苦參堿抗炎靶點可視化分析

通過生物信息在線作圖平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制韋恩圖，對苦參堿抗炎靶點進行可視化處理。

1.4 蛋白相互作用網絡的構建

登錄String數據庫(https://string-db.org/)，導入苦參堿發(fā)揮抗炎作用的潛在靶點并選擇“homo sapiens”物種，獲取靶點蛋白相互作用關系；minimum required interaction score選擇medium confidence(0.400)并導出PPI互作圖和tsv文件；將tsv文件導入Cytoscape 3.7.2軟件繪制蛋白相互作用網絡，利用Network Analyzer工具對網絡進行拓撲學分析，節(jié)點大小和顏色深淺用于反映degree的大小，邊的粗細用于反映combine score的大小。利用Network Analyzer工具對網絡進行拓撲學分析，選取節(jié)點連接度(degree)的兩倍中位數為篩選標準，以節(jié)點連接度(betweeness)、節(jié)點緊密度(closeness)的中位數作為篩選依據繪制Hithubs網絡，篩選核心靶點。

1.5 GO功能分析和KEGG通路分析

登錄DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)，導入苦參堿發(fā)揮抗炎作用的潛在靶點并選擇“homo sapiens”物種，select identifier設置為official gene symbol，list type設置為gene list，對苦參堿抗炎靶點進行GO分析和KEGG通路分析，導出txt文件。將靶點數目進行降序排列，對GO的3個 分支Biological Process、Molecular Function及Cellular Component靶點數排列前20的生物過程繪制柱狀圖；利用Bioconductor中的R包對靶點數排列前20的KEGG Pathway繪制氣泡圖。

1.6 藥物-靶點-通路網絡構建

登錄Cytoscape 3.7.2軟件(https://cytoscape.org/)，導入苦參堿抗炎靶點及通路信息，構建“藥物-靶點-通路”網絡圖。

1.7 苦參堿與靶點分子對接驗證

登錄Pubchem數據庫，下載配體苦參堿結構并保存為sdf格式，利用openbabel轉為mol2格式，利用AutodockTools1.5.6打開配體小分子，并加氫、加電荷、檢測配體的root、進行可旋轉鍵的搜尋與定義，并保存為pdbqt文件。登錄RCSB Protein Data Bank，下載核心靶點蛋白IGFⅠ、MAPK8、CASP3、NR3C1的3D結構，在AutodockTools1.5.6中打開，通過添加所有的氫原子、計算Gasteiger電荷、合并非極性氫后，將其定義為受體并保存成pdbqt文件。根據配體的位置，最終確定Vina分子對接的坐標和盒子大小，為了增加計算的準確度，將參數exhaustiveness設置為20。除了特別說明，其他參數均采用默認值。采用Autodock vina 1.1.2進行半柔性對接，選取affinity最佳的構象，作為最終的對接構象。選取對接結合能量最低的構象用于對接結合模式分析，并使用PyMol進行作圖。

2 結 果

2.1 苦參堿抗炎靶點的篩選

通過PharmMapper數據庫收集到118個苦參堿潛在作用靶點，通過GeneCards數據庫收集到263個抗炎靶點，將上述苦參堿靶點和抗炎靶點取交集，獲得23個苦參堿發(fā)揮抗炎作用的潛在靶點(表1)。

2.2 苦參堿抗炎靶點可視化分析

登錄生物信息在線作圖平臺，在成比例文氏圖(Venn diagram)的疾病靶點和藥物靶點中分別輸入抗炎靶點和苦參堿作用靶點，通過韋恩圖對苦參堿抗炎靶點進行可視化(圖1)。

2.3 構建蛋白互作網絡

將篩選出的23個苦參堿抗炎潛在靶點輸入String數據庫，限制物種為人，獲取蛋白互作網絡(圖2)，節(jié)點數為23，邊數為52，預期的邊數為14，平均節(jié)點度值為4.52，平均局部聚類系數為0.524，PPI富集P值為4.44×10-15，保存為tsv文件。將文件導入Cytoscape 3.7.2軟件，根據其度值繪制柱狀圖(圖3)，由圖可見度值排名前5的靶點包括IGFⅠ、MAPK8、CASP3、NR3C1及MAPK14；游離靶點包括PPARD、CYP2C9及LTA4H。利用Network Analyzer工具對網絡進行拓撲學分析，選取節(jié)點連接度(Degree)的兩倍中位數(10.4)為篩選標準，以節(jié)點連接度(betweeness)中位數(0.007 761 435)和節(jié)點緊密度(closeness)中位數(0.567 297)作為篩選依據繪制Hithubs網絡，篩選核心靶點，結果見圖4。由圖4可知苦參堿抗炎核心靶點為IGFⅠ、MAPK8、CASP3、NR3C1。

2.4 GO功能分析和KEGG通路分析

將篩選出的23個苦參堿抗炎靶點輸入DAVID 數據庫，物種限定為人，進行GO功能分析，共獲得116個富集結果。獲得生物過程(biological process)81個，細胞組分(cellular component)8個，分子功能(molecular function)27個。其中，生物過程涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、信號轉導、類固醇激素介導的信號通路、凋亡過程的負調節(jié)、蛋白質磷酸化等。細胞組分涉及核質、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子復合物、細胞質、細胞核、受體復合物等。分子功能涉及蛋白質結合、鋅離子結合、類固醇激素受體活性、序列特異性DNA結合、蛋白激酶活性等。將GO功能分析中生物過程、細胞組分、分子功能的degree值排列前20的過程繪制柱狀圖(圖5～7)。KEGG 通路分析共獲得47個通路，利用Bioconductor中的R包對靶點數排列前20的KEGG Pathway繪制氣泡圖(圖8)。

表1 苦參堿抗炎靶點

2.5 苦參堿-靶點-通路網絡構建

將DAVID通路注釋得到的數據，通過Cytoscape3.7.2軟件構建苦參堿靶點-代謝通路-疾病網絡模型(圖9)。Network Analyzer結果顯示，網絡節(jié)點數為71，網絡邊數為217，網絡密度為0.087，網絡直徑為4，網絡半徑為2，網絡中心度為0.483、網絡異質性為1.217，最短路徑為4 970，特征路徑長度為2.378，平均網絡度為6.113。

2.6 苦參堿的分子對接驗證

選取Hithubs網絡中的4個核心靶點(IGFⅠ、MAPK8、CASP3、NR3C1)，利用AutoDock Vina軟件分別與苦參堿進行分子對接(表2)。為了從分子水平闡明蛋白與化合物的作用模式，將苦參堿對接至核心蛋白的活性口袋，理論結合模式如圖10～13所示。由圖可以看出，苦參堿與CASP3蛋白氨基酸LYS53形成鍵長為3.4 ?的氫鍵作用；與IGFⅠ蛋白氨基酸TYR60形成鍵長為3.4 ?的氫鍵作用；與MAPK8蛋白氨基酸ASN156形成鍵長為3.4 ?的氫鍵作用;與NR3C1蛋白氨基酸ARG558形成鍵長為3.4 ?的氫鍵作用，這些相互作用使得蛋白與化合物形成復合物，由于IGFⅠ蛋白較小，對接結合自由能較高，因此，可能不是很穩(wěn)定，而蛋白MAPK8與苦參堿對接結合能較低，可形成穩(wěn)定的復合物。因此，MAPK8為苦參堿的最佳結合靶點。

圖1 苦參堿靶點和抗炎靶點交集Fig.1 Intersection of matrine and anti-inflammatory targets

圖2 苦參堿抗炎潛在靶點蛋白相互作用網絡Fig.2 Potential target protein interaction network of matrine

3 討 論

目前，利用網絡藥理學技術在藥物作用靶點的預測和機制的研究方面已取得良好的成效。沈汶等[17]在研究銀黃藥對的抗病毒作用機制時，運用PharmMapper網絡服務器、DAVID數據庫、String數據庫等預測關鍵蛋白，發(fā)現(xiàn)銀黃藥對抗病毒作用的靶點主要有CDK2、CDK7、SRC、DHFR、CHEK1、CCNA2等，可能通過抑制DNA前體合成來發(fā)揮抗病毒作用。崔琳琳等[18]在陳皮干預COVID-19機制研究中，利用TCMSP數據庫、GeneCards數據庫及分子對接技術等獲得MAPK、MAPK8、CASP3、MAPK1、PTGS2、CAT、PPARG、NOS2等核心靶蛋白，提示陳皮可能通過抗病毒、抗炎、調控細胞凋亡、調節(jié)免疫等途徑，發(fā)揮抑制肺纖維化的作用。

圖3 苦參堿抗炎潛在靶點度值排序Fig.3 Order of anti-inflammatory potential target values of matrine

圖4 苦參堿抗炎靶點蛋白Hithubs網絡Fig.4 Hithubs network of matrine anti-inflammatory target proteins

圖5 苦參堿抗炎靶點的生物過程Fig.5 Biological process of matrine anti-inflammatory target

利用PharmMapper和Genecards數據庫挖掘到23個苦參堿抗炎靶點。利用String和Cytoscape數據庫構建蛋白互作網絡，通過連接度(degree)、節(jié)點連接度(betweeness)、節(jié)點緊密度(closeness)篩選出4個核心靶點，即IGFⅠ、MAPK8、CASP3和NR3C1。IGFⅠ又被稱為胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ,IGFⅠ)，是胰島素樣生長因子家族重要的一員。研究發(fā)現(xiàn)，IGFⅠ在免疫系統(tǒng)炎癥調節(jié)方面發(fā)揮著重要作用。小鼠感染流感病毒后IGFⅠ表達上調，IGFⅠ R磷酸化水平升高，促進下游PI3K/AKT和MAPK8中的P38信號通路的激活進而促進炎癥反應[19-20]。半胱天冬酶(caspase)是一類天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族，caspase-3是其最主要的成員之一[21]，被稱為細胞凋亡的代表性效應CASP，最近也被稱為焦亡的炎性介質。Suzuki等[22]在caspase-3缺陷小鼠免疫相關腎病研究中，發(fā)現(xiàn)caspase-3缺陷小鼠表現(xiàn)出腎炎癥、輕度脾腫大和炎性基因表達上調，表明caspase-3在炎癥反應中起重要作用。NR3C1是糖皮質激素受體基因(nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1),糖皮質激素(glucocorticoids,GC)是腎上腺皮質細胞分泌的一種類固醇激素，具有強大的抗炎和對組織細胞的免疫抑制作用[23]，廣泛用于治療包括類風濕性關節(jié)炎和哮喘在內的不同炎癥性疾病[24]。糖皮質激素受體(glucocorticoid reccptor,GR)是介導GC發(fā)揮作用的重要轉錄調控因子，GC作用于NR3C1進而抑制炎癥基因表達是抗炎有效性的核心[25]。MAPK8又被稱為c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1,JNK1)，是MAPKs 家族的重要成員之一，在炎癥等病理過程中起著重要的調控作用[26-27]。研究表明，PRRSV感染能夠激活MAPK信號通路，促進MAPK信號通路中JNK、p38和ERK1/2的磷酸化[28]。雷瑩瑩[28]在親和蛋白A對PRRSV增殖的影響及其作用機制的研究中，發(fā)現(xiàn)在親和蛋白A作用后，不影響PRRSV感Marc-145細胞中的JNK的表達，但明顯抑制其磷酸化過程。余志彬[29]在PRRSV誘導白介素-12產生的分子機制研究中，發(fā)現(xiàn)PRRSV感染可以誘導IL-12p40和IL-12p35的表達，且PRRSV對IL-12p40的誘導依賴于JNK-AP-1和NF-κB的信號途徑。Liu等[30]研究表明PRRSV可能通過TAK-1/JNK/AP-1途徑誘導IL-8的產生。運用分子對接技術計算4個核心蛋白與苦參堿分子的結合能，結果可知MAPK8與苦參堿分子的結合能最低，形成的復合物最穩(wěn)定，因此，MAPK8可能是苦參堿發(fā)揮抗PRRSV作用的主要靶點。通過苦參堿抗炎作用靶點、通路的挖掘，為苦參堿抗PRRSV作用機制的深入研究奠定基礎。

圖6 苦參堿抗炎靶點的細胞組分Fig.6 Cellular components of matrine anti-inflammatory target

圖7 苦參堿抗炎靶點的分子功能Fig.7 Molecular function of anti-inflammatory matrine target

圖8 苦參堿抗炎靶點的KEGG分析Fig.8 KEGG analysis of matrine anti-inflammatory targets

圖9 苦參堿-靶點-通路的網絡模型Fig.9 Network model of matrine-target-pathway

表2 核心靶蛋白與苦參堿對接結果

a. 苦參堿與IGFI對接的整體圖； b. 苦參堿與IGFI對接的局部作用圖 a. Overall diagram of matrine docking to IGFI; b. Local action diagram of matrine docking to IGFI圖10 苦參堿與IGFI對接的最佳構象相互作用示意圖Fig.10 Schematic diagram of the optimal conformational interaction of matrine docked to IGFⅠ

a.苦參堿與MAPK8對接的整體圖；b. 苦參堿與MAPK8對接的局部作用圖 a. Overall diagram of matrine docking to MAPK8; b. Local action diagram of matrine docking to MAPK8圖11 苦參堿與MAPK8對接的最佳構象相互作用示意圖Fig.11 Schematic diagram of the optimal conformational interaction of matrine docked to MAPK8

a.苦參堿與CASP3對接的整體圖；b. 苦參堿與CASP3對接的局部作用圖 a. Overall diagram of matrine docking to CASP3; b. Local action diagram of matrine docking to CASP3圖12 苦參堿與CASP3對接的最佳構象相互作用示意圖Fig.12 Schematic diagram of the optimal conformational interaction of matrine docked to CASP3

a. 苦參堿與NR3C1對接的整體圖；b. 苦參堿與NR3C1對接的局部作用圖 a. Overall diagram of matrine docking to NR3C1; b. Local action diagram of matrine docking to NR3C1圖13 苦參堿與NR3C1對接的最佳構象相互作用示意圖Fig.13 Schematic representation of the optimal conformational interaction of matrine docked to NR3C1

4 結 論

MAPK8是苦參堿發(fā)揮抗炎作用的主要靶點，苦參堿可能通過作用于MAPK8這一關鍵蛋白發(fā)揮抗炎作用，進而達到抗PRRSV的作用。