新疆野生荒漠肉蓯蓉醇提物調節小鼠DCs成熟對Th1/Th2的免疫增強作用

楊秀梅，楊 雨，王丹陽，張愛蓮

(新疆大學 生命科學與技術學院, 新疆生物資源與基因工程重點實驗室，烏魯木齊830046)

中草藥含有多種免疫調節成分，中草藥中的黃酮、多糖以及皂苷等具有良好的免疫調節作用[1-3]。近年來，中草藥活性成分作為有效的免疫刺激物在防治人和動物多種疾病中發揮了重要的作用。補益類中藥一般均能較好地增強機體的免疫功能，提高機體的免疫力，且對正常細胞沒有毒副作用，是良好的生物反應調節劑，作為天然、安全生物活性成分的來源用于動物和人類傳染病的防治有著不可替代的優勢。

新疆荒漠肉蓯蓉 (Cistanchedeserticola)為列當科植物，產于我國新疆等荒漠化干旱地區，是一種具有極高藥用價值的中草藥，有“沙漠人參”的美譽，作為補益類中藥在中國等地被普遍用作滋補食品已有多年歷史[4-6]。研究者對肉蓯蓉已經做了大量的研究，主要針對肉蓯蓉有效成分分離、藥理作用，藥物療效，肉蓯蓉的化學組成等方面開展了深入而細致的研究，分離了百余種化合物，包括苯乙醇苷、木脂素類及生物堿和多糖等成分[7-9]，可以增強機體的免疫功能，具有抗衰老、抗氧化以及免疫調節等作用[10-14]。由于不同中草藥的活性成分含量有很大的差別，從具有免疫活性的中草藥中進行廣泛篩選，尋找合適的中草藥活性成分對于動物和人類各種疾病的防治具有實際的意義。

為了闡明新疆野生荒漠肉蓯蓉醇提物對特異性免疫反應的調節性質和強度，基于中藥有效成分可以通過激活抗原提呈細胞樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)的成熟和功能而發揮重要的免疫調節作用[15-17]，本研究以新疆野生荒漠肉蓯蓉醇提物為研究材料，OVA為抗原，采用皮下途徑免疫小鼠，檢測體液和細胞免疫反應，以及促進DCs成熟和對Treg的影響，通過深入探究新疆野生荒漠肉蓯蓉醇提物對OVA特異性免疫應答的特點和作用機制的初步研究，為篩選具有良好免疫調節作用的中草藥活性成分的研究和新型疫苗佐劑的發現提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康ICR小鼠，雌性(5～6周齡，體重18～22 g) 購于新疆醫科大學動物中心，進行適應性飼養1周后開始試驗。新疆野生荒漠肉蓯蓉(EEWCD，其中，苯乙醇苷類化合物含量為17.12%，作者實驗室制備)[18]；OVA、噻唑藍(MTT)、刀豆蛋白A (concanavalin A, ConA) 和脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS) 均購自Sigma公司；鋁佐劑 (Imject Alum Adjuvant, Alum)購自Thermo公司；羊抗鼠過氧化物酶抗體(IgG-HRP、IgG1-HRP、IgG2a-HRP)購自美國Southern Biotech公司；Cytofix/Cytoperm buffer、Perm/Wash buffer、CD4-FITC、CD8-FITC、IL-4-PE、IFN-γ-APC、CD11c-PE、CD40-FITC、CD80-APC、CD86-APC和MHCII-FITC抗體購自BD公司。Treg染色試劑盒購自eBioscience公司。其他各類試劑和耗材均為國產或進口產品。

1.2 免疫及分組

EEWCD用Tween-20:0.9% NaCl =1∶9溶解。EEWCD與溶解在0.9% NaCl 的OVA配制成疫苗后備用。小鼠免疫抗體檢測分組見表1，共分為7組，每組5只小鼠，0.9% NaCl 組為空白對照組，EEWCD為對照組，Alum和OVA為陽性對照組，其他組為試驗組。皮下免疫兩次，間隔2周，免疫前眼眶采集小鼠血，制備血清后用于抗體檢測。MTT、細胞因子、DCs及Treg檢測采用同樣的策略免疫小鼠，免疫分組見表1，在抗體檢測分組的基礎上增加了Tween-20為對照組。

表1 小鼠抗體水平、MTT檢測分組設計(n=5)

1.3 EEWCD免疫小鼠后抗體滴度及亞類檢測

EEWCD與OVA皮下免疫小鼠后，小鼠眼眶采血，收集初免疫后各個時間點血清，間接ELISA法檢測OVA特異性IgG抗體滴度及分型：將OVA抗原(2.5 μg·mL-1)包被96孔板后4 ℃ 過夜。將稀釋好的血清加入到96孔板中37 ℃ 孵育1 h。 接著，加入IgG-HRP、IgG1-HRP和IgG2a-HRP的抗體稀釋液到96孔板中，37 ℃避光1 h。加入TMB顯色液，避光顯色10～20 min后，加入終止液終止反應，酶標儀上檢測OD450 nm/OD655 nm的值。

1.4 EEWCD免疫小鼠后對脾細胞增殖的檢測

ELISA檢測初次免疫后21 d小鼠血清中IgG抗體水平，驗證抗體有效后，采用MTT法檢測EEWCD對脾細胞的增殖作用：制備初次后21 d脾單細胞懸液，加入96孔細胞培養板后，分別加入20 μL 濃度為10 μg·mL-1的 OVA、10 μg·mL-1的 OVA323-339、5 μg·mL-1的ConA和5 μg·mL-1的 LPS刺激細胞48 h，設置3個復孔，未處理的空細胞和空培養基為對照。刺激后加入20 μL 的5 mg·mL-1的MTT，37 ℃孵育3～4 h，棄上清后，加入DMSO溶解甲瓚顆粒后，檢測OD570 nm/OD630 nm值，計算刺激指數SI (stimulation index, SI)：(OD處理- OD培養基)/(OD未處理-OD培養基)。

1.5 FCAS檢測胞內細胞因子

采用FACS進行CD4+IL-4、CD4+IFN-γ和CD8+IFN-γ的檢測，具體步驟：初次免疫后21 d，制備脾單細胞懸液，將細胞濃度調整為2×107個·mL-1， 單細胞懸液鋪到24孔板細胞培養中，OVA刺激4 h，加入Golgi stop繼續孵育12 h，收集細胞，Perm/Washing buffer洗滌2次，先進行細胞表面分子CD4-FITC和CD8-FITC染色，避光20 min，細胞用Cytofix/Cytoperm buffer進行固定和破膜后，Perm/Washing buffer洗滌細胞后，分別加入IL-4和IFN-γ，避光孵育15～20 min，Perm/Wash buffer洗滌細胞后，FACS檢測，FlowJo 7.6軟件分析檢測結果。

1.6 FCAS檢測DCs表面分子

采用FCAS檢測EEWCD對小鼠脾中DCs的成熟和Treg的影響：制備初次免疫后21 d 脾單細胞懸液，用PBS洗滌細胞后，進行DCs表面分子CD11c-PE、CD40-FITC、CD80-APC、CD86-APC和MHCII-FITC避光染色20 min，FACS檢測，FlowJo分析結果。

1.7 FCAS檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞

用eBioscience試劑盒進行檢測EEWCD對小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的影響，具體操作：PBS洗滌脾單細胞，CD4-APC和CD25-FITC細胞避光染色20 min，用eBioscience Fixation/Permeabilization buffer的進行固定破膜細胞，室溫孵育20 min，Permeabilization buffer洗滌后，加入PBS后，FCAS檢測，FlowJo分析結果。

1.8 EEWCD對小鼠生長狀況的影響

EEWCD皮下免疫小鼠后，在免疫前和免疫后不同時間點觀察小鼠行為，測量小鼠體重，觀察小鼠的日常行為，同時，檢測EEWCD免疫后對小鼠體重的影響，初步判斷EEWCD免疫小鼠后的安全性。

1.9 數據分析

2 結 果

2.1 EEWCD對OVA特異性抗體滴度的影響

為了檢測EEWCD對體液免疫的影響，采用ELISA檢測了初免后14、21、35和49 d小鼠血清中OVA特異性的抗體滴度。從圖1中可以看出，EEWCD的抗體滴度與0.9% NaCl空白對照組相當，免疫后各組的抗體滴度隨著免疫時間的增加抗體水平有所增加，與OVA處理組相比，EEWCD-M組和EEWCD-H組在21、35和49 d均能夠提高OVA特異性抗體2倍左右，抗體滴度為18萬～24萬，Alum 組的抗體滴度為24萬～30萬。EEWCD-M組和EEWCD-H組抗體水平高于EEWCD-L組，EEWCD-M為最佳劑量組，Alum組為抗體水平最高劑量組。這些結果表明，EEWCD可以提高體液免疫水平。

圖1 初免后不同時期EEWAR對OVA特異性抗體滴度的影響(n=5)Fig.1 Detection of IgG titer in different time after immunization(n=5)

2.2 EEWCD對OVA特異性抗體亞類的影響

小鼠初免后35 d對其抗體分型進行了檢測，圖2的結果表明，EEWCD-M和EEWCD-H極顯著促進OVA特異性IgG水平(P<0.01)，顯著促進了IgG1的水平(P<0.05)，與鋁佐劑沒有顯著差異(P>0.05)； EEWCD-M極顯著促進IgG2a的水平(P<0.01)，與Alum相比差異顯著(P<0.05)，EEWCD-H顯著促進IgG2a的水平(P<0.05)，與Alum相比差異不顯著(P>0.05)。這表明EEWCD不僅可以提高體液免疫水平，也可以促進Th1和Th2的免疫反應，與Alum相比，尤其是可以促進Th1的反應。

2.3 EEWCD對脾細胞增殖的影響

采用MTT法進行了EEWCD對小鼠脾細胞增殖的檢測。首先，采用間接ELISA檢測小鼠初免后21 d抗體水平，如圖3 A所示，EEWCD-L、EEWCD-M和EEWCD-H均能夠顯著或極顯著促進抗體水平(P<0.05或P<0.01)，Alum也能夠極顯著促進抗體水平(P<0.05)，EEWCD-M為最佳劑量，且與Alum之間無顯著差異(P>0.05)。在此基礎上，采用MTT法檢測了EEWCD對脾細胞增殖的影響，如圖3B-E所示，在OVA和OVA323-339刺激下，EEWCD-L、EEWCD-M和EEWCD-H均能夠顯著或極顯著促進脾細胞增殖水平(P<0.05或P<0.01)，EEWCD-M和EEWCD-H的刺激作用顯著高于Alum (P<0.05)，EEWCD-M為最佳劑量。在ConA和LPS刺激下，EEWCD-L、EEWCD-M、EEWCD-H和Alum對脾細胞增殖的作用也達到了顯著或極顯著的水平(P<0.05或P<0.01)， EEWCD-M和EEWCD-H顯著高于Alum(P<0.05)，且EEWCD-M為最佳劑量。試驗結果表明，EEWCD可以促進OVA特異性的脾細胞增殖。

與OVA組相比, *.P<0.05; **.P<0.01;與Alum組相比，#.P<0.05 Compared with OVA group, *. P<0.05; **.P<0.01; Compared with Alum group, #.P<0.05圖2 EEWCD對OVA特異性抗體亞型的影響(n=5)Fig.2 Effects of the EEWCD on OVA-specific IgG subclasses (n=5)

2.4 EEWCD對T細胞分泌細胞因子的作用

細胞因子在調節免疫細胞功能和防御感染中起重要的作用。為了檢測EEWCD對IL-4和IFN-γ分泌的影響，EEWCD加強免疫7 d后，分離制備小鼠脾單細胞懸液，與OVA抗原體外共培養后進行CD4+/IL-4、CD4+/IFN-γ、CD8+/IFN-γ染色，FACS檢測結果如圖4，EEWCD-M顯著促進CD4+T細胞IL-4和IFN-γ的分泌(P<0.05)，與Alum相比差異顯著(P<0.05)；EEWCD-M極顯著促進CD8+T細胞IFN-γ的產生(P<0.01)，與Alum相比差異顯著(P<0.05)。綜上表明，EEWCD可以促進細胞因子的產生，尤其促進了IFN-γ的產生。

2.5 EEWCD對DCs成熟的影響

DCs在調節免疫反應中發揮了重要的作用，采用FACS檢測了初免后21 d小鼠脾細胞中DCs共刺激分子CD80、CD40、CD86和MHCII的表達水平，探究EEWCD對DCs成熟的影響。從圖5可以看出，EECCD-M極顯著CD40的表達水平(P<0.01)， EECCD-L、EWCCD-M和EWCCD-H均能夠極顯著促進CD80和MHCII的表達(P<0.01)，與Alum相比差異顯著(P<0.05)。EWCCD-M、EWCCD-H和Alum可以顯著增強CD86的表達(P<0.05)，與Alum相比差異不顯著(P>0.05)。這些結果表明，EEWCD可以促進DCs的成熟。

2.6 EEWCD對Treg的影響

為了更好地了解EEWCD在免疫應答中的調節作用，小鼠加強免疫后7 d，利用FACS檢測了CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的變化。如圖6所示，與OVA組相比，EECCD-L、EWCCD-M和EWCCD-H極顯著降低了CD4+CD25+Foxp3+Treg頻率(P<0.01)，Alum也極顯著降低了Treg頻率(P<0.01)，EWCCD處理組和Alum組沒有顯著差異，EEWCD可以顯著下調Treg的水平。

2.7 EEWCD免疫小鼠對體重的影響

EEWCD免疫小鼠后，觀察小鼠的日常行為，每周稱量小鼠的體重，觀察整個免疫期間EEWCD對小鼠的影響。在整個免疫期間小鼠無任何異常行為，如沒有脫毛、拒食等現象，在同一時間點，各組體重之間無顯著差異(P<0.01)，同一組小鼠隨著免疫時間的延長體重也在不斷增加，詳見表2。

3 討 論

中草藥在動物和人類疾病治療中起著重要的作用，如黃芪多糖作為口蹄疫疫苗的免疫增強劑能夠提供更好的免疫保護作用，枸杞多糖可通過抑制炎癥改善過敏性哮喘，人參醇提物具有良好的抗炎活性等[19-22]，由于中草藥活性成分良好的免疫調節活性和安全性，因此，許多中草藥用于免疫調節活性物質的篩選研究。本研究選取新疆荒漠地區的益補類中藥荒漠肉蓯蓉醇提物為研究材料，已有研究表明，肉蓯蓉醇提物中主要活性成分是苯乙醇苷，具有抗炎，抗病毒，免疫調節等多種功能[9,23-26]。利用已經建立的體內疫苗佐劑篩選平臺，采用動物試驗對荒漠肉蓯蓉醇提物進行體內免疫調節活性評價，通過檢測DCs成熟和Treg的表達來初步分析其作用機制。在動物模型中，發現EEWCD針對OVA抗原具有良好的免疫增強活性，在EEWCD免疫的小鼠中未觀察到炎癥反應和異常行為，提示EEWCD具有一定的安全性。

與OVA組相比, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.001; 與Alum組相比，#.P<0.05, ##.P<0.01, ###.P<0.001 Compared with OVA group, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.001; Compared with Alum group, #.P<0.05, ##.P<0.01, ###.P<0.001圖3 EEWCD對脾細胞增殖的影響Fig.3 Effects of EEWCD on splenic lymphocyte proliferation

與OVA組相比, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.01； 與Alum組相比，#.P<0.05 Compared with OVA group, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.001; Compared with Alum group, #.P<0.05圖4 EEWCD對CD4+和CD8+T細胞IL-4和IFN-γ分泌的影響Fig.4 Analysis of EEWCD on IL-4 and IFN-γ in CD4+ and CD8+ T cells

中草藥活性成分對非特異和特異性免疫反應及各類免疫細胞的功能有明顯的調節作用，可以促進T/B淋巴細胞的活化、抗原遞呈細胞的成熟和功能[27-28]，且這些免疫調節作用存在一定的量效關系[29]。試驗中篩選到EEWCD-M和EEWCD-H提高OVA特異性IgG抗體滴度2～3倍，僅次于Alum，且EEWCD沒有免疫原性。從MTT試驗中可以看出，與Alum相比，EEWCD的3個劑量都可以更好地促進OVA和OVA323-339特異性的脾細胞增殖，激活T/B細胞，EEWCD-M為最佳劑量。這些結果說明EEWCD通過激發有效的B/T淋巴細胞促進體液免疫反應和細胞免疫反應。

與OVA組相比, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.01； 與Alum組相比，#.P<0.05 Compared with OVA group, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.001; Compared with Alum group, #.P<0.05圖5 EEWCD對DCs表面分子表達的影響Fig.5 Analysis of Co-stimulatory molecules in DCs by FACS

與OVA組相比, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.01 Compared with OVA group, *.P<0.05; **.P<0.01, ***.P<0.01圖6 EEWCD對Treg表達水平的影響Fig.6 Effects of the EEWCD on Treg frequency

表2 EEWCD對小鼠體重的影響

Th1/Th2反應是動物機體產生保護性免疫反應所必需，Th1免疫反應是機體抵御某些傳染病的關鍵，如口蹄疫、禽流感、豬瘟等[30-32]。為了闡明EEWCD對OVA抗原的Th1/Th2免疫效應特點，本研究結果顯示，EEWCD-M和EEWCD-H可以增強IgG1(Th2)和IgG2a(Th1)的抗體水平，尤其可以增強IgG2a的水平，效果優于Alum，Alum只能顯著促進IgG1抗體水平；細胞因子檢測的結果表明，EEWCD-M 顯著促進了CD4+和CD8+T細胞分泌IL-4和IFN-γ，效果優于Alum。這部分研究結果說明EEWCD增強了對OVA抗原特異性的Th1/Th2免疫反應，尤其可以促進IFN-γ的分泌增強Th1免疫反應，這對于各種動物傳染病的防治有積極的意義。

DCs在誘導和調節免疫反應中發揮了重要作用。DCs通過捕獲和遞呈抗原激活抗原特異性T細胞，分泌免疫調節性細胞因子，調控B淋巴細胞和T淋巴細胞的功能，DCs的激活或成熟對免疫調節至關重要，很多中草藥活性成分可以通過促進DCs的成熟和功能促進特異性的免疫反應[1，15，33]。Treg細胞可提高體液和細胞反應，調節免疫平衡[34]。為了初步闡明EEWCD增強OVA特異性免疫反應的機制，FACS檢測了免疫后小鼠脾中DCs的成熟情況，結果顯示，EEWCD-M顯著上調了DCs的表面分子CD40、CD80、CD86和MHC-II的表達，下調了Treg的表達，說明EEWCD可以通過促進DCs的成熟和抑制Treg頻率來提高OVA特異性的體液和細胞免疫應答。

4 結 論

通過體內試驗評價EEWCD對OVA特異性免疫應答的特點，EEWCD可以通過激活DCs，下調Treg，增加抗體水平，促進細胞因子的產生從而增強Th1和Th2應答，尤其可以增強Th1的反應，EEWCD展示出了良好的免疫調節活性。