miR-365 對胃癌SGC-7901 細胞的作用及其機制

鄭啟煒，塔拉，白瑞霞

（內蒙古自治區人民醫院檢驗科，內蒙古 呼和浩特 010017）

胃癌是一種發生在人的胃黏膜上皮細胞中的惡性腫瘤。我國胃癌高發，據統計每年胃癌新增病例接近40 萬[1，2]。并且胃癌在我國各種惡性腫瘤中發病率居首位，每年約17 萬人死于該病。miR-365抑制胃癌細胞的增殖，并普遍參與多種消化道腫瘤的發生、發展[3]。細胞周期失控、超常運行等情況都會導致癌瘤的發生，如果停滯不前細胞將衰老和凋亡。其中Cyclin D1在細胞從G1期進入S期的過程中發揮著重要作用，也決定著細胞能否能繼續的生長與增殖[4]。p21 基因是細胞周期蛋白依靠性激酶抑制劑家族中的一個重要成員[5]。與腫瘤的抑制作用密切相關[4]。本研究通過探究miR-365對胃癌細胞的影響，以期為新的調控胃癌的發生、發展，具體機制的研究以及治療來開辟新的思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

大學病原生物與免疫學研究室惠贈RGM-1 細胞和SGC-7901 細胞；轉染試Lipofectamine2000（Invitrogen），實時熒光定量PCR 等實驗所用試劑均購于大連寶生物工程公司；由上海英濰捷基貿易服務有限公司合成實驗所需的質粒表達載體。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養RPMI-1640培養基中培養細胞。

1.2.2 實時熒光定量PCR 方法檢測miR-365 的表達取對數生長期的SGC-7901 細胞，提取細胞總RNA 設計miR-365 及內參基因的PCR引物，以相應的cDNA 作為模板，擴增按照實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行。

1.2.3 細胞轉染將對數生長期的SGC-7901 的細胞收集，隨機分為3 組：miR-365 轉染組，陰性對照轉染組和空白對照組。轉染組中加入3μg的miR-365 mimics 和300 μL脂質體。將質粒和脂質體分混合均勻后加入培養基中。培養了48 h后，將3組的對數生長期細胞分別收集好后，每組細胞中miR-365的表達采用RT-PCR方法檢測，觀察其轉染效果。

1.2.4 MTT 法繪制生長曲線取三組細胞，每組接種6 個孔，于96 孔板。培養24h 以后，再分別于第1、2、3、4、5 天的時候在每個復孔中分別加入20μL 50mg/mL 的MTT 液體，繼續培養24h 后，檢測各組細胞的光吸收值（A值），時間為x 軸，A值為y 軸，繪制出胃癌SGC-7901 細胞生長曲線（酶聯儀570nm波長條件下檢測）。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡上流式細胞儀檢測穩定轉染48h 后的三組細胞，分別檢測每組的凋亡率。

1.2.6 Western blotting檢測蛋白 收集轉染48 h 后三組細胞，提取蛋白。12% 的SDS-PAGE 凝膠電泳。轉移到NC 膜，用5%脫脂奶粉封閉，然后加入一抗（1:800），放置于4 ℃冰箱過夜。第二天取出并加入對應的1:3 000 的堿性磷酸酶標記的二抗（羊抗兔IgG），室溫放置反應1 h。最后電化學發光顯色拍照。

1.3 統計學處理

用SPSS 20.0 的統計學分析軟件對實驗數據進行統計學分析，兩組時為t檢驗，多組時為單因素方差分析。結果以平均數±標準差表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-365的表達及其轉染效果

胃癌SGC-7901細胞中miR-365的表達水平顯著低于RGM-1 細胞（P＜0.05）（見表1）。轉染組中miR-365 表達較陰性對照組和空白對照組均有顯著升高（P＜0.05），陰性對照組與空白對照組miR-365的表達差異無統計學意義（P＞0.05）（見表2）。

表1 RGM-1細胞和SGC-7901細胞miR-365的表達水平

表2 miR-365的表達水平

2.2 miR-365對胃癌SGC-7901細胞增殖的作用

miR-365轉染組的細胞生長速度從第三天開始變慢，明顯低于陰性對照轉染組和空白對照組細胞的生長速度（P＜0.05）；而陰性對照轉染組與空白對照組細胞的生長速度相比沒有明顯差異（P＞0.05）（見圖1）。

圖1 細胞生長曲線

2.3 miR-365對胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響

miR-365 對胃癌SGC-7901 細胞的凋亡是有促進作用（見表3，圖2）。

表3 轉染組、陰性對照組、空白對照組細胞的凋亡率

圖2 miR-365 對胃癌胃癌SGC-7901細胞凋亡的作用

2.4 miR-365 對胃癌 SGC-7901 細胞 p21、Cyclin D1蛋白表達的影響

用Western blotting 的方法檢測p21 蛋白和Cyclin D1蛋白的表達。

實驗結果顯示轉染48h 的Cyclin D1 蛋白表達量顯著降低，而p21 蛋白表達量較空白組相比顯著升高（P＜0.05）（見圖3、4）。

圖3 Cyclin D1、p21的western blot 結果

圖4 Cyclin D1、p21蛋白表達量

3 討論

MicroRNAs是近年來發現并研究較熱的一類很重要的基因調節分子。有研究表明在一些惡性腫瘤中，有些microRNAs 表達與相應癌旁對照存在明顯不同，另外microRNAs在生物體的發育、腫瘤的發生等生理及病理過程中發揮著某些重要的作用。很多研究結果顯示腫瘤患者的預后與microRNAs的表達水平有一定關系。這就提示我們，尋找那些在腫瘤中發揮作用的microRNAs 并研究它們的作用機制，可為microRNAs 在腫瘤中的作用的研究提供新的思路，同時也為其在腫瘤的診斷和治療方面進一步開拓思路[6～8]。

Cyclin 參與調控細胞周期的進程。CyclinD1 的蛋白分子量接近34KD，是與細胞周期關系密切一個關鍵性的基因，除了主要參與調控細胞G1 期限制點，同時也是參與調控細胞增殖，其在細胞從Gl期進入S 期的過程中發揮著關鍵作用，甚至決定著細胞能否繼續增殖與生長。CyclinD1的表達異常會引起的細胞周期的失控進而會導致細胞異常增殖并癌變[9]。有研究證明CyclinD1 與腫瘤的發生、發展關系密切，因此，近些年里有大量研究CyclinD1在乳腺癌、胃癌等癌細胞中的作用[4]。

胃癌的發生過程是一個極其復雜的，癌細胞的細胞凋亡受阻、惡性增殖及具體的作用機制等都有待進一步研究[10]。miR-365 在多種腫瘤組織中表達下調。本研究發現，miR-365 在胃癌SGC-7901細胞中呈低表達，通過轉染的方法，表明miR-365表達能夠明顯，促進細胞的凋亡，同時使細胞凋亡的重要調控成員Cyclin D1 表達下調，p21 蛋白的表達上調，提示miR-365 可能通過下調cyclin D1 和上調 p21 蛋白的表達來抑制胃癌細胞的增殖[9，11，12]。本研究結果或可作為胃癌的早期篩查以及胃癌的治療潛在的靶分子，并為下一步的臨床研究奠定基礎。也希望后期有更多實驗多方來論證。