毛干檢材STR基因分型成功率的影響因素研究

鄭陽(yáng)陽(yáng),鄭文彥,吳偉斌,杜蔚安

(廣東華美眾源生物科技有限公司，廣東 佛山 528000)

自然脫落毛發(fā)是法醫(yī)常見物證檢材之一，在案件偵破中具有重要線索與證據(jù)價(jià)值[1]。帶毛囊毛發(fā)的短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分型技術(shù)成熟、可靠，已廣泛用于個(gè)體識(shí)別、親緣關(guān)系鑒定等[2-3]。而在案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)采集到的毛發(fā)樣本70%是處于休眠期的脫落毛發(fā)，毛囊退化或只剩下毛干，DNA分型難度較大，目前，常用辦法是測(cè)序分析線粒體DNA高度變異D-環(huán)區(qū)[4]。雖然線粒體DNA含量比核DNA豐富，檢出率更高[5-6]，但存在母系遺傳、異質(zhì)性、分析數(shù)據(jù)無(wú)法進(jìn)入數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)等缺點(diǎn)[7-8]，導(dǎo)致其應(yīng)用范圍和案件線索作用有限。本研究從毛干DNA含量、DNA降解程度、黑色素抑制3個(gè)方面入手，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析和驗(yàn)證了無(wú)毛囊毛干檢材在STR分型過程存在的難點(diǎn)，并初步研究了解決策略，以提高無(wú)毛囊毛干的分型成功率。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本采集 2019年10月收集15名健康志愿者毛干樣本，均為健康志愿者自然脫落毛發(fā)(未經(jīng)染燙等化學(xué)處理)；用木梳輕輕梳理頭皮，收集存留在梳子上的毛發(fā)，肉眼觀察毛根部位體積較小、呈干癟堅(jiān)硬狀，顯微鏡下觀察毛球萎縮、無(wú)根鞘附著。單根毛干實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量選擇長(zhǎng)度為20 cm的毛發(fā)，若單根長(zhǎng)度小于20 cm可選擇多根混合使用，計(jì)算疊加長(zhǎng)度。采集健康志愿者口腔唾液樣本作為對(duì)照樣本(毛干樣本與唾液對(duì)照樣本分型結(jié)果一致的基因座計(jì)為成功分型基因座)。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照采用人類基因組DNA 9947A。

1.1.2主要試劑與儀器 Qubit-iT dsDNA HS Assay試劑盒(ABI,美國(guó))、AGCU Expressmarker 16CS STR分型試劑盒(無(wú)錫中德美聯(lián)，中國(guó))、黑色素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-aldrich，美國(guó))、Qubit熒光定量系統(tǒng)(ABI,美國(guó))、Mastercycler?nexus聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(Eppendorf，德國(guó))、3130XL型遺傳分析儀(ABI,美國(guó))、GeneMapper ID-X數(shù)據(jù)分析軟件(ABI,美國(guó))等。引物合成由上海生工生物工程公司完成。

1.2方法

1.2.1樣本前處理與DNA提取 從靠近毛根端剪去2 cm后將毛干樣本剪至長(zhǎng)度0.5 cm若干段，用10%次氯酸鈉溶液清洗[9-10]，再加入1%十二烷基硫酸鈉溶液800 μL浸泡5 min，期間不斷渦旋混勻，用1 mL無(wú)水乙醇與無(wú)菌水各清洗1次，室溫晾干。加入600 μL裂解液(0.01 M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(pH 8.0)、2%十二烷基硫酸鈉、0.005 M乙二胺四乙酸、100 mM氯化鈉、300 mM二硫蘇糖醇、1 mg/mL蛋白酶K等56 ℃消化2 h；采用chelex-100螯合法或磁珠法進(jìn)行提取純化。

1.2.2DNA定量 使用Qubit熒光定量系統(tǒng)對(duì)毛干提取液進(jìn)行DNA定量分析，基于高靈敏熒光染料與核酸分子結(jié)合后被激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合的核酸分子數(shù)呈正比的原理，利用已知質(zhì)量濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體操作參照Qubit-iT dsDNA HS Assay kit說明書進(jìn)行。根據(jù)DNA定量結(jié)果與初始檢材量計(jì)算每毫克毛發(fā)DNA含量及單根毛干DNA含量。

1.2.3DNA降解分析 根據(jù)定量結(jié)果篩選質(zhì)量濃度較高的DNA提取產(chǎn)物，利用3組引物進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，對(duì)比不同大小片段的擴(kuò)增效果以驗(yàn)證評(píng)估DNA降解情況。擴(kuò)增引物根據(jù)人類基因組3個(gè)不同遺傳多態(tài)性位點(diǎn)自主設(shè)計(jì)、產(chǎn)物片段大小分別為80～88、142～145、212～266 bp 3個(gè)區(qū)間。引物序列見表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過3130XL遺傳分析儀進(jìn)行分離分析，將12μL去離子甲酰胺與0.5 μL分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)Marker SIZ-500混合。加入1 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，渦旋混勻，3 000 r/min離心2 min，95 ℃變性3 min，冰浴3 min，進(jìn)行毛細(xì)管電泳。利用GeneMapper?ID-X軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物電泳峰圖，比較不同大小區(qū)域的片段出峰情況以評(píng)估DNA降解程度。以無(wú)降解的人類基因組標(biāo)準(zhǔn)DNA9947A作為對(duì)照。

表1 不同長(zhǎng)度擴(kuò)增產(chǎn)物引物序列

1.2.4毛發(fā)黑色素對(duì)STR的影響測(cè)定 設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)測(cè)定毛發(fā)黑色素對(duì)STR分型的影響及產(chǎn)生影響的臨界質(zhì)量濃度。將人類基因組DNA 9947A溶液加入一系列不等量的毛發(fā)黑色素標(biāo)準(zhǔn)品，配制黑色素終質(zhì)量濃度為28、32、36、40、44、48、52、56、60、64 ng/μL的PCR反應(yīng)體系，DNA模板量維持為0.5 ng/μL，按AGCU Expressmarker 16CS STR分型試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)各基因座出峰情況。產(chǎn)物毛細(xì)管電泳與數(shù)據(jù)分析方法與1.2.3項(xiàng)相同。

1.2.5STR分型條件優(yōu)化 采用Chelex-100螯合法提取毛干DNA，利用Microcon100超濾柱進(jìn)行濃縮，所得產(chǎn)物利用人類常染色體mini-STR分型試劑盒進(jìn)行基因分型。此外，通過嘗試增加PCR體系中鎂離子(Mg2+)、DNA聚合酶濃度或?qū)NA聚合酶與牛血清清蛋白(BSA)預(yù)孵育處理等途徑緩解黑色素抑制作用，進(jìn)而優(yōu)化單根毛干樣本STR分型條件。

2 結(jié) 果

2.1單根毛干DNA含量 初始毛干檢材用量為30～50 mg，1 mg頭發(fā)相當(dāng)于單根毛干(長(zhǎng)度20 cm)重量[11]，據(jù)此將DNA提取產(chǎn)物的定量數(shù)值換算為單根毛干平均DNA含量值。隨機(jī)抽取的8名健康志愿者中除1名DNA含量高達(dá)0.78 ng外，其余DNA含量為0.01～0.35 ng。8名健康志愿者單根毛干DNA含量具有較大差異。見圖1。

圖1 8名健康志愿者單根毛干DNA含量比較

2.2毛干DNA降解評(píng)估 除個(gè)別樣本(圖2a)可得到80、142、212 bp 3個(gè)產(chǎn)物峰外，其余5名健康志愿者毛干樣本均只能在小片段區(qū)域得到1個(gè)或2個(gè)產(chǎn)物峰，而大片段區(qū)域的擴(kuò)增全部失敗(圖2b)，而標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照9947A則能成功擴(kuò)增到3個(gè)目標(biāo)區(qū)域的相應(yīng)產(chǎn)物峰(圖2c)。說明毛干DNA存在降解。

a.健康志愿者C毛干樣本；b.健康志愿者A、D、E、F、G毛干樣本；c.標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照9947A。

2.3毛發(fā)黑色素對(duì)STR分型的影響 當(dāng)PCR反應(yīng)體系中黑色素質(zhì)量濃度大于或等于36 ng/μL時(shí)個(gè)別基因座出現(xiàn)等位基因丟峰現(xiàn)象；當(dāng)PCR體系中黑色素質(zhì)量濃度大于或等于60 ng/μL時(shí)16個(gè)基因座所有等位基因全部擴(kuò)增失敗，同時(shí)試劑盒自帶的內(nèi)參基因座IC也無(wú)法正常出峰，說明此時(shí)黑色素對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抑制作用。見圖3。

注：紅色表示擴(kuò)增后丟峰的基因座；綠色表示分型正確的基因座。

2.4單根毛干STR分型優(yōu)化結(jié)果 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化前毛干樣本STR分析的基因座檢出率為41.2%。增加Mg2+質(zhì)量濃度對(duì)分型效果無(wú)改善作用，但適當(dāng)增加DNA聚合酶質(zhì)量濃度能提高基因座檢出率，且當(dāng)DNA聚合酶質(zhì)量濃度為0.4 U/μL時(shí)基因座檢出率提高至58.8%，改善效果最為明顯。見表2。在反應(yīng)前先采用10 μM BSA對(duì)DNA聚合酶于56 ℃條件下預(yù)處理30 min基因座檢出率可進(jìn)一步提高至70.6%。見圖4。隨機(jī)選取4名健康志愿者單根毛干樣本(長(zhǎng)20 cm)進(jìn)行分型測(cè)試，優(yōu)化前基因座檢出率分別為35.3%、41.2%、41.2%、47.1%；其中3名健康志愿者單根毛干樣本成功分型基因座大于或等于10個(gè)，基因座檢出率分別為58.8%、70.6%、64.7%；1名健康志愿者單根毛干樣本優(yōu)化后基因座檢出率為52.9%。毛干樣本STR分型成功率具有個(gè)體差異。見圖5。

表2 不同質(zhì)量濃度Mg2+、DNA聚合酶基因座檢出率比較

圖4 單根毛干優(yōu)化后STR分型圖譜

注：紅色表示擴(kuò)增后丟峰的基因座；綠色表示分型正確的基因座。

3 討 論

由于毛干DNA含量極低，提取產(chǎn)物的定量分析難度較大，因此，本研究將初始檢材量提高至30～50 mg，并選用Qubit熒光定量系統(tǒng)、利用熒光染料與雙鏈DNA的特異性結(jié)合提高定量的靈敏度與準(zhǔn)確性；單根毛干DNA含量計(jì)算結(jié)果與HEYWOOD等[12]得出的0.40 ng DNA結(jié)論較為接近。此外，不同個(gè)體毛干DNA含量差異較大，推測(cè)這也是導(dǎo)致毛干檢材DNA分型失敗率高的一個(gè)重要因素。

法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室常用的商業(yè)化試劑盒的檢測(cè)靈敏度為0.05～0.10 ng；在實(shí)際測(cè)試過程中0.05 ng標(biāo)準(zhǔn)品模板常能夠得到完整分型，而同等甚至更高模板量的毛干DNA卻無(wú)法得到大片段產(chǎn)物峰，說明毛干STR分型失敗不僅是由毛干提取產(chǎn)物模板量太低所致，也與DNA降解或抑制物密切相關(guān)。為克服DNA降解問題，本研究利用mini-STR技術(shù)原理，通過在更靠近核心重復(fù)序列的兩端側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)引物，使PCR產(chǎn)物的片段大小縮短至300 bp以內(nèi)，以提高小片段基因組DNA的檢測(cè)成功率。

由于毛干DNA含量極少，如極力追求特殊的、針對(duì)去除黑色素的純化效率高的純化方案，勢(shì)必會(huì)嚴(yán)重影響DNA得率[13]。因此，為減少DNA損失考慮采用chelex-100提取法，但此法對(duì)黑色素去除沒有太大效果。相關(guān)研究表明，1 mg人毛發(fā)中黑色素含量為0.055 mg，據(jù)此計(jì)算，單根毛發(fā)STR分型體系中黑色素質(zhì)量濃度為48.8 ng/μL[14]；基于研究結(jié)果，此質(zhì)量濃度的STR分型成功率會(huì)受到嚴(yán)重抑制，基因座檢出率小于47.1%。因此，若要提高毛干STR分型成功率必須改善黑色素的抑制作用[15-16]。本研究在經(jīng)過多輪實(shí)驗(yàn)摸索后發(fā)現(xiàn)，將反應(yīng)體系中聚合酶質(zhì)量濃度提高至0.4 U/μL并利用BSA對(duì)DNA聚合酶預(yù)處理能有效改善反應(yīng)效果，使基因座檢出率提高至70.6%；然而需要注意的是，同一實(shí)驗(yàn)條件下不同個(gè)體來源樣本的基因座檢出率差異仍較大，分析原因可能是由于不同個(gè)體毛干DNA含量的差異及角質(zhì)細(xì)胞中DNA降解程度的差異所致。因此，尚需進(jìn)一步研究，以使毛干檢材發(fā)揮更大的檢測(cè)價(jià)值。