七氟烷對不同性別新生大鼠認知功能影響的差異分析

武健，李萌萌，郝濟偉，孟令超，張慶紅，郝薏晴

1錦州醫科大學解放軍總醫院第四醫學中心研究生培養基地，北京 100048；2解放軍總醫院第四醫學中心麻醉科，北京 100048；3全軍創傷修復與組織再生重點實驗室，北京 100048

七氟烷具有芳香味，且不易燃、起效快、麻醉恢復快，常用于小兒全身麻醉[1]。對嚙齒類動物的研究發現，麻醉劑暴露對動物的學習記憶功能可產生持久的影響，且海馬神經失調在認知功能障礙的發生發展中起重要作用。既往基礎研究多選用雄性動物，以避免雌孕激素水平波動干擾實驗結果，但認知水平的發展具有明顯的性別差異[2]。人類流行病學調查顯示，早期麻醉暴露可對男性認知功能產生長期的影響，而對女性的認知功能影響較輕，其生理學機制尚待進一步研究[3-4]。新生大鼠反復給予丙泊酚，僅雄性表現出非空間記憶受損[5]。應激及性激素相關研究發現，異丙酚麻醉可導致新生大鼠體內皮質類固醇激素如皮質酮和醛固酮分泌增多[6]。Chastain-Potts等[7]研究表觀遺傳修飾發現，出生7 d的幼鼠暴露于七氟醚6 h可導致神經元DNA甲基化程度降低，且暴露組雌性大鼠所生雄性幼鼠Arc和JunB mRNA表達上調，具有性別差異，這些改變可能進一步導致神經發育和行為異常。然而七氟烷暴露對新生大鼠內分泌、海馬神經元發生和認知功能影響的性別差異研究較少。本研究旨在探討七氟烷對不同性別新生大鼠認知功能影響的差異。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 出生7 d (P7)的SD大鼠82只，購自北京科宇動物養殖中心，隨機分為對照組與七氟烷處理組，然后按照性別分為以下亞組：雌性對照組、雄性對照組、雌性七氟烷處理組、雄性七氟烷處理組，每組19～22只。采用ALC-HTP動物恒溫系統維持P7幼鼠體溫在(36.5±0.5) ℃。室溫保持在20～25 ℃，相對濕度60%～70%，通風良好，自由攝取食物和水。本研究通過解放軍總醫院動物倫理委員會批準(2019-X06-11)，實驗過程符合國家和單位有關實驗動物的管理和使用規定。

1.2七氟烷處理 測量各組大鼠體重，然后置于一個透明有機玻璃麻醉誘導盒中，對照組自由呼吸空氣4 h，七氟烷處理組吸入4%七氟烷麻醉4 h。采用實驗動物麻醉機(美國MATRX公司)以6%七氟烷麻醉誘導，4%七氟烷與30%氧氣混合維持麻醉4 h，期間監測幼鼠的呼吸頻率，每隔15 min夾尾，確保存活，開啟二氧化碳吸附器吸收廢氣[8-10]。

1.3ELISA法檢測血清皮質酮、雌二醇(E2)水平 自主呼吸/七氟烷暴露4 h后，各組隨機取6只大鼠，斷頸取血0.5 ml于抗凝管中，常溫靜置2 h，4 ℃下2500 r/min離心15 min，取上清于-20 ℃保存。采用ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)檢測皮質酮、E2水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4免疫組化法檢測海馬Ki-67和神經元核心抗原(NeuN)的表達 自主呼吸/七氟烷暴露4 h后，各組隨機取5只大鼠，經左心室灌注生理鹽水50 ml，繼續灌注預冷的4%多聚甲醛100 ml，灌注完畢后斷頭，收集大腦標本，采用免疫組化法檢測大鼠海馬CA1區及齒狀回(DG)區神經細胞的增殖和分化情況，具體操作步驟參照文獻[11]。加入Ki-67、NeuN一抗(1:100，北京中杉金橋生物技術有限公司)和相應二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，采用ImageJ軟件分析并計數切片中1 mm2視野內Ki-67、NeuN陽性細胞數。

1.5曠場實驗[12]觀察大鼠行為學變化 大鼠(P21)在安靜黑暗實驗室中適應30 min后，將其放入曠場箱(長×寬×高：100 cm×100 cm×40 cm)中心位置，自由探索5 min，記錄大鼠在曠場中央區及周圍區所待時間。

1.6Morris水迷宮實驗[13]測定大鼠認知功能 各組大鼠(P35)進行連續15 d的Morris水迷宮實驗，測試分為以下5步：(1)環境適應。大鼠在水迷宮實驗室自由攝取食物和水，每天2 h，連續5 d。(2)獲得性訓練。水溫維持在(26±1) ℃，將大鼠頭朝池壁放入水中，隨機取東、西、南、北4個方向之一，記錄大鼠找到水下平臺的時間及移動距離，以在平臺上停留30 s為結束；如超過60 s，則將大鼠引導至平臺，并停留30 s。每天4次，間隔15～20 min，連續訓練5 d，記錄大鼠平臺潛伏期和移動距離等。 (3)探查訓練。將平臺撤除，大鼠由原平臺對側象限放入池中1 min，記錄大鼠逃避潛伏期時間、逃逸距離、游泳速度、原平臺穿越次數、目標象限次數、目標象限耗時等。(4)對位訓練。將大鼠放置于原平臺所在象限的對側象限，方法同獲得性訓練，連續3 d，記錄大鼠平臺潛伏期和移動距離等。(5)對位探查訓練。方法與探查訓練類似，記錄大鼠逃避潛伏期時間、逃逸距離、游泳速度、原平臺穿越次數、目標象限次數、目標象限耗時等。

1.7統計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用析因設計的方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1七氟烷處理對新生大鼠血清皮質酮、E2的影響 ELISA檢測結果顯示，與對照組相比，七氟烷處理組大鼠外周血血清皮質酮水平明顯升高[(7.93±1.58) ng/ml vs. (11.60±1.41) ng/ml，P<0.001]，E2水平無明顯差異[(35.0±8.25) pmol/L vs. (34.2±9.73) pmol/L，P>0.05]。不同性別各亞組間比較，大鼠外周血血清皮質酮、E2水平差異無統計學意義(P>0.05，圖1)。

圖1 七氟烷處理對新生大鼠血清皮質酮、E2的影響Fig.1 Effects of sevoflurane exposure on serum cortisone and estradiol of postnatal rats

2.2七氟烷處理對新生大鼠海馬神經干細胞和成熟神經元的影響 免疫組化檢測結果顯示，與對照組相比，七氟烷處理組大鼠海馬CA1區和DG區Ki-67陽性細胞數明顯減少[(27.5±5.2) 個/mm2vs. (19.3±2.9) 個/mm2；(72.5±10.6) 個/mm2vs. (47.2±4.9) 個/mm2，P<0.05]，不同性別各亞組間比較差異無統計學意義(P>0.05，圖2)。與對照組相比，七氟烷處理組大鼠海馬CA1區和DG區NeuN陽性細胞數亦明顯減少[(117.8±16.4) 個/mm2vs. (79.4±13.1) 個/mm2；(468.5±40.5) 個/mm2vs. (390.0±23.2) 個/mm2，P<0.05]，不同性別各亞組間比較差異無統計學意義(P>0.05，圖2)。

2.3七氟烷處理對新生大鼠行為學的影響 曠場實驗結果顯示，對照組與七氟烷處理組大鼠中央區及周圍區探索時間比較差異無統計學意義[中央區：(18.34±10.15) s vs. (18.91±11.38) s，P>0.05；周圍區：(325.10±20.89) s vs. (335.90±11.89) s，P>0.05，圖3]；不同性別各亞組間比較差異無統計學意義(P>0.05，圖3)。

2.4七氟烷處理對新生大鼠認知功能的影響

2.4.1獲得性訓練及探查訓練結果 Morris水迷宮實驗結果顯示，獲得性訓練第1、2、3天，不同處理組及不同性別大鼠平臺潛伏期和移動距離比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。獲得性訓練第4、5天，與雄性對照組相比，雄性七氟烷處理組大鼠平臺潛伏期、移動距離均明顯延長[平臺潛伏期：(13.56±2.67) s vs. (22.40±7.20) s，P=0.009； (9.23±3.93) s vs. (15.18±1.70) s，P=0.01；移動距 離：(348.01±69.49) cm vs. (632.23±159.43) cm， P=0.046；(290.50±68.06) cm vs. (492.03±199.80) cm， P=0.030，圖4A、B]；雌性對照組與雌性七氟烷處理組大鼠平臺潛伏期、移動距離差異無統計學意義(P>0.05)。提示七氟烷處理組雄性大鼠隨后的空間定位能力可能受到影響，但在探查訓練中，各處理組及不同性別大鼠平臺潛伏期、游泳速度、目標象限次數及目標象限耗時比較，差異均無統計學意義(P>0.05，圖4C－F)。

圖2 七氟烷處理對新生大鼠海馬神經干細胞和成熟神經元的影響 Fig.2 Effects of sevoflurane exposure on hippocampal neural stem cells and mature neurons of postnatal rats

2.4.2對位訓練及對位探查訓練結果 對位訓練第1、3天，不同處理組及不同性別大鼠平臺潛伏期、移動距離比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。第2天，與雄性對照組相比，雄性七氟烷處理組大鼠平臺潛伏期、移動距離均延長[(12.19±7.52) s vs. (25.08±6.02) s，P=0.025；(343.25±113.40) cm vs. (566.87±141.81) cm，P=0.015，圖5A、B]；雌性對照組與雌性七氟烷處理組大鼠平臺潛伏期、移動距離差異無統計學意義(P>0.05)。對位探查訓練中，各處理組及不同性別大鼠游泳速度、目標象限次數比較，差異均無統計學意義(P>0.05，圖5D、E)；但與雄性對照組相比，雄性七氟烷處理組大鼠平臺潛伏期明顯延長[(12.51±2.66) s vs. (8.67±1.03) s，P<0.01，圖5C]，目標象限耗時明顯縮短[(28.23±3.07) s vs. (19.69±4.71) s，P=0.031，圖5F]。

圖3 七氟烷處理對新生大鼠行為學的影響Fig.3 Effects of sevoflurane exposure on the ethology of postnatal rats

圖4 七氟烷處理對新生大鼠獲得性訓練及探查訓練結果的影響Fig.4 Effects of sevoflurane exposure on the results of acquired and exploration training of postnatal rats

3 討 論

揮發性麻醉劑被廣泛應用于臨床，但其作用機制及對神經系統發育的影響尚不明確。研究發現，發育期麻醉藥物暴露對大鼠隨后的神經系統發育具有一定的影響，且存在性別差異[8-9]，其生理機制有待進一步研究。Xie等[14]發現，七氟醚麻醉可損害成年大鼠的短期認知功能，且對雄性大鼠的損害較雌性重，其機制可能是通過下調磷酸化cAMP反應元件結合蛋白1(p-CREB1)、Bcl-2的表達，上調caspase-8的表達，從而促進海馬神經元凋亡。本研究發現，七氟烷處理明顯增高了大鼠外周血血清皮質酮水平，但對E2水平無明顯影響；七氟烷處理可抑制海馬神經干細胞的增殖及海馬神經元發生，但無性別差異；七氟烷處理對雄性大鼠的空間認知功能有一定影響，但對雌性大鼠無明顯影響。

圖5 七氟烷處理對新生大鼠對位訓練及對位探查訓練結果的影響Fig.5 Effects of sevoflurane exposure on the results of counterpoint training, and counterpoint exploration training of postnatal rats

神經甾體是由腦組織細胞合成的甾體激素，可能參與調控γ-氨基丁酸A型受體(gamma-aminobutyric acid type A receptor，GABAAR)的活性并對神經系統發育產生影響[15-16]。研究發現，七氟烷可通過激活邊緣系統-下丘腦-垂體-腎上腺軸(limbichypothalamo pituitary adrenal axis，LHPA軸)引起神經活性甾體釋放[17]。Xu等[18]發現，七氟烷暴露6 h可導致新生大鼠皮質酮水平增高。早期應激如長期或反復的母子分離，可導致后期嚴重的行為異常，以及對應激表現出更強烈的內分泌反應，成年雄性嚙齒動物可能表現出更明顯的異常[19]。E2是神經活性甾體激素，在發育期腦內維持于較高水平，大腦皮質中含量無性別差異，但雄性大鼠下丘腦中含量明顯高于雌性[20-21]。孕晚期或出生后早期大鼠給予外源性E2，可降低成年后雌性大鼠的學習記憶功能[22]。 本研究結果顯示，七氟烷處理可明顯增高新生大鼠血清皮質酮水平，與既往研究結果一致[18]，但未發現性別差異；七氟烷處理對新生大鼠血清E2水平無明顯影響，分析原因為麻醉引起的E2水平升高主要發生在腦內，但由于實驗條件限制，本研究未測定各組大鼠麻醉后腦內神經活性甾體激素的水平，因此，七氟烷處理對發育期大鼠E2的影響是目前研究的重要局限。

神經元發生是神經干細胞不斷增殖、分裂產生新神經元的過程。全身麻醉藥物引起的大鼠認知功能障礙主要表現為海馬控制的空間定向力受損及學習記憶功能下降，但其發生機制尚未明確[23]。有研究發現，海馬顆粒下區齒狀回神經干細胞產生發育成熟神經元的能力是決定海馬功能的重要因素[24]。 膿毒癥小鼠海馬齒狀回神經干細胞分化減少，成熟神經元凋亡增加，學習和空間記憶功能隨之受 損[25]。Ki-67是一種細胞增殖相關核抗原，其功能與細胞有絲分裂密切相關，是目前判斷細胞增殖能力的主要指標之一。NeuN是成熟神經元的特異性標志物。景靈等[26]使用七氟烷處理老年大鼠，發現大鼠海馬神經干細胞(Ki-67標記)、成熟神經元(NeuN標記)和星形膠質細胞(GFAP標記)明顯減少，出現神經發生失衡現象。本研究結果顯示，吸入4%七氟烷可導致新生大鼠海馬Ki-67、NeuN陽性細胞明顯減少，神經干細胞增殖受損。新生期海馬神經干細胞作為海馬神經元發生的起始點，其數量減少對海馬正常發育可能造成一定的影響，且可能影響遠期的神經功能。

有研究發現，多次異氟烷處理與出生后嚙齒類動物大腦神經元凋亡和認知功能障礙相關[27]。與雌性大鼠相比，雄性大鼠對麻醉藥(異氟醚或苯巴比妥)的神經毒性作用更敏感，主要表現為海馬神經元數量明顯減少[28]。Rothstein等[29]認為，突觸形成早期階段(出生后即刻)全麻暴露大鼠的認知能力嚴重受損，且對成年期(1.5個月)雄性大鼠的影響較雌性大鼠重。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一種分泌性蛋白質，參與調控神經元的生長和發育，且與突觸形成有關，而雌激素已被證實能增加BDNF的表達[30]， 這可能是麻醉藥物對雌性影響較小的原因。目前Morris水迷宮為測試大鼠學習記憶功能的經典模型，主要用于客觀評價大鼠空間認知功能的行為學研究。為排除七氟烷處理可能引起新生大鼠隨后的精神焦慮、探索能力下降等自主行為改變，本研究在Morris水迷宮實驗前，進行了曠場實驗篩查，結果顯示，出生后經歷七氟烷處理的大鼠，其精神狀況、探索及自主行為等無異常改變。Morris水迷宮實驗中，七氟烷處理的雄性大鼠在獲得性訓練和對位訓練中的平臺潛伏期及移動距離均延長，提示七氟烷處理可能僅影響新生大鼠學習過程中的表現，而對隨后的空間認知能力無明顯影響，與既往研究結果一致[31]；同時在對位探查訓練中平臺潛伏期及非目標象限耗時均延長，提示七氟烷處理對新生雄性大鼠的工作記憶能力有一定損害。由此可見，七氟烷處理對新生雄性大鼠隨后的認知功能有一定影響，但在雌性大鼠的行為學研究中未發現類似 結果。

麻醉劑不僅影響細胞凋亡，還可影響神經炎 癥[32]、神經元信號變化、細胞增殖及突觸形成[33-34]， 但這些影響可通過雌激素和孕酮激素的保護作用而減輕[35]。17β-雌二醇可通過激活PI3K/Akt/Bcl-2信號通路對氯胺酮誘導的神經元凋亡發揮神經保護作用[36]。但本研究中，七氟烷處理對新生大鼠血清皮質酮和E2的影響不能解釋行為學上的性別差異。有研究發現，異氟醚處理的雄性大鼠與雌性大鼠海馬和丘腦核內神經元死亡情況相似[37]。Ju等[38]發現，大鼠暴露于七氟醚，其后代在行為測試和鉀離子-氯離子共轉運體2(KCC2)表達方面出現性別差異，僅雄性表現異常。由于激素水平的差異以及麻醉對神經系統發育可能產生的影響，雌性大鼠的恢復及適應能力可能更具彈性。

綜上所述，本研究結果顯示，七氟烷處理對新生大鼠血清皮質酮水平影響較大，且可抑制海馬神經干細胞增殖及神經元發生，成年后雄性大鼠的學習能力有所減退，但對雌性大鼠無明顯影響。麻醉劑對不同性別大鼠生理及學習認知行為的影響仍有待進一步探討。