NLRP3介導的細胞焦亡在大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的作用*

岳榮川 盧圣忠 羅瑜 楊小利 王小波 秦丹 鄭在勇 呂明明 胡厚祥

(1.川北醫學院附屬醫院心血管內科，四川 南充 637000；2.陸軍軍醫大學大坪醫院心血管內科， 重慶 400042)

急性心肌梗死病情兇險，常危及患者生命，及時的血運重建可挽救缺血心肌，但同時造成的心肌缺血/再灌注損傷影響了再灌注治療的療效[1-2]。既往研究[2-3]中分別給予清除自由基、減輕鈣超載、抗炎等措施減少心肌細胞凋亡或調節自噬的策略在臨床治療中未見明顯的療效。鑒于心肌缺血/再灌注損傷防治中遇到的瓶頸，人們意識到可能還存在其他形式的心肌損傷。焦亡以細胞膜的快速破裂和胞內炎性內容物的釋放為主要特點，是區別于凋亡和壞死的一種獨特的程序性細胞死亡[4]。Caspase-1對細胞焦亡的形成具有決定性作用，除此之外其還通過激活pro-IL-1β及pro-IL-18引發或加重炎性反應[5]。相關研究[6-7]表明，心肌缺血/再灌注損傷可能與細胞焦亡有關。同時，NLRP3炎性小體與缺血/再灌-損傷的關系也引起了大家的關注[8]。因此，我們推測缺血/再灌注誘導的心肌細胞焦亡可能與NLRP3有關。為了驗證這一假設，我們通過結扎和打開SD大鼠冠狀動脈前降支的方法建立大鼠心肌缺血/再灌注損傷的動物模型，觀察缺血/再灌注后焦亡的發生情況，并通過抑制焦亡來明確焦亡在心肌缺血/再灌注損傷中是否發揮了重要的作用，同時我們通過干預NLRP3炎癥小體對缺血/再灌注誘發焦亡的發生機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 小動物呼吸機(中國，成都泰盟軟件有限公司)，胸腔撐開器(中國，蘇州醫療器械有限公司多功)，手術顯微鏡(中國，蘇州六六視覺科技股份有限公司)，脫水儀(中國，湖北慧達儀器有限公司)，生物組織包埋機(中國，廣東賽威科技有限公司)，組織切片機(德國，Leica公司)，恒溫水浴箱(中國，蘇州醫療器械有限公司)，病理組織漂烘儀(中國，常州市郝思琳醫用儀器有限公司)，激光共聚焦顯微鏡(美國，Olympus公司)，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色液(中國，碧云天生物技術研究所)，NLRP3單克隆抗體(美國，Santa公司)，Caspase-1單克隆抗體(美國，Novus公司), IL-1β單克隆抗體(美國，Abcam公司),Z-YVAD-FMK(美國，Santa公司)，Tunel試劑盒(瑞士，Roche公司)，MCC950(美國,MCE公司)，Tropomyosin單克隆抗體(美國，Abcam公司),Cy3標記紅色驢抗山羊IgG(中國，武漢艾美捷科技有限公司)。

1.2 實驗動物 75只SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(180～200 g)飼養于定濕、定溫的動物室內，由川北醫學院實驗動物中心提供。飼養和實驗遵守川北醫學院實驗動物管理和使用規定并遵守中國實驗動物管理條例(1998 年衛生部第 55 號文件)。實驗前自由飲水，禁食12 h。

1.3 根據文獻中的方法[9]建立缺血/再灌注模型 腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)將大鼠麻醉，呼吸機支持呼吸，備皮后用碘酒及酒精消毒手術區皮膚，于左側胸前第四五肋間剪開皮膚(橫向)約3 cm，剪開肋間第一二層肌肉，稍加分離，鈍性分離肋間第三層肌肉，用開胸器暴露心臟，分開心包膜，于左心耳下2～3 mm結扎(活結)冠狀動脈左前降支(于結扎線間墊一個小墊以大鼠心肌被撕裂)，結扎后可見左心室前壁組織由紅色變為黃白色證明結扎成功，關閉胸腔，30 min后重新打開胸腔，用剪刀將結扎線剪開，關閉胸腔，縫合皮膚(24 h后取組織標本)。

1.4 實驗分組及干預 采用抓鬮法將SD大鼠隨機分為兩組。①對照組：只進行手術操作，不結扎冠狀動脈。②缺血/再灌注組：進行缺血/再灌注處理。③YVAD組：假手術前8小時和4小時腹腔注射Z-YVAD-FMK(10 mg/kg)[10]。④YVAD+缺血/再灌注組：進行缺血/再灌注處理前8小時和4小時腹腔注射Z-YVAD-FMK(10mg/kg)。⑤MCC950組：假手術前30分鐘尾靜脈注射MCC950(3 mg/kg)[11]。⑥MCC950+缺血/再灌注組：進行缺血/再灌注處理前30分鐘尾靜脈注射MCC950。

1.5 Western Blot檢測蛋白水平 各組心肌組織進行相應處理以后，根據我們之前的方法[12]提取細胞蛋白，測定蛋白濃度，取等量蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳后將分離的蛋白質轉移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉2 h，分別加入相應的抗體和內參照蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入與一抗相匹配的二抗，室溫下避光孵育1 h，再次洗膜后利用ODYSSEY-紅外凝膠掃描系統掃描膜顯示條帶，通過條帶的灰度值進行定量分析。

1.6 心肌2,3,5,-氯代三苯基四氮唑(TTC)染色 根據我們之前的實驗方法[7,13]，先配制1%的TTC溶液備用，將心臟迅速取出放在-80 ℃冰箱中冷凍10 min，然后用刀片自心尖至心底依次垂直于長軸橫切成1 mm左右的心肌片段，接著將心肌片浸入1%TTC溶液中，放入37℃恒溫箱中孵育10 min，再用4%多聚甲醛固定8 h，最后照相統計心肌梗死面積。

1.7 Tunel及心肌組織免疫熒光染色 根據之前的方法[12]通過Tunel染色來檢測心肌組織中的細胞焦亡。不同組的大鼠經過相應處理后，取出心臟進行固定、脫水、包埋、切片、抗原修復、封閉，然后參照我們之前的實驗方法進行Tunel染色，然后孵育tropomyosin抗體及相應的熒光二抗進行免疫熒光染色，最后進行DAPI染色。在雙盲條件下計算各組Tunel陽性細胞占總細胞的比例。

2 結果

2.1 各組心肌梗死面積、心肌細胞Tunel染色及焦亡蛋白水平 為明確心肌缺血/再灌注損傷時是否有細胞焦亡存在，我們將對照組與缺血/再灌注組進行了比較。與對照組相比，缺血/再灌注組大鼠的心臟梗死面積明顯增加(P<0.05)，見圖1A；與對照組相比，血/再灌注組Tunel染色陽性率明顯增多(P<0.05)，見圖1B。與對照組相比，缺血/再灌注組中NLRP3表達水平明顯升高，Caspase-1、IL-1β及GSDMD-N的激活也明顯增加(均P<0.05)，見圖1C。提示缺血/再灌注可以誘導心肌梗死及心肌細胞調亡。

圖1 心肌缺血/再灌注損傷發生時細胞焦亡增加

2.2 Caspase-1抑制劑Ac-YVAD-CMK通過抑制焦亡減輕心肌缺血/再灌注損傷 YVAD+缺血/再灌注組Tunel染色陽性率高于對照組，明顯低于缺血/再灌注組(均P<0.05)，見2A；YVAD+缺血/再灌注組梗死面積高于對照組，明顯低于缺血/再灌注組(均P<0.05)，見2B；YVAD+缺血/再灌注組caspase-1、IL-1β及GSDMD-N的表達水平高于對照組，明顯低于缺血/再灌注組，見2C～F(均P<0.05)。說明caspase-1抑制劑Ac-YVAD-CMK可以抑制焦亡并減輕心肌缺血/再灌注損傷。

2.3 NLRP3炎癥小體的活化介導了缺血/再灌注引起的心肌細胞焦亡 為了明確缺血/再灌注誘導的心肌細胞焦亡是否是由NLRP3炎癥小體介導的，我們用NLRP3抑制劑MCC950抑制NLRP3炎癥小體的活化來進一步檢測。結果表明，MCC950成功抑制了缺血/再灌注組NLRP3蛋白的表達(圖3A、B)；MCC950還顯著地降低了缺血/再灌注所致的心肌細胞內caspase-1(圖3C)、IL-1β(圖3A、D)及GSDMD-N(圖3A、E)的蛋白表達水平的升高。同時，可以看到MCC950有效抑制了缺血/再灌注所致的Tunel染色陽性率的升高(圖3F)和心肌梗死面積的增加(圖3G)。表明缺血/再灌注引起的心肌細胞焦亡與NLRP3炎癥小體有關，抑制NLRP3炎癥小體的激活可以減少細胞焦亡從而減輕心肌缺血/再灌注損傷。

圖2 抑制焦亡對心肌缺血/再灌注損傷的影響

圖3 NLRP3炎癥小體對缺血/再灌注誘導的心肌細胞焦亡的影響

3 討論

細胞焦亡是最近定義的一種細胞死亡形式，與其他的細胞死亡形式不同，其特點包括Caspase-1活化、細胞膜孔的形成和細胞內容物的釋放。近年來焦亡在心血管疾病中的作用得到廣泛的關注。焦亡不僅可導致細胞死亡，還可以導致組織損傷的級聯反應。有研究[14-15]表明心肌細胞焦亡在心衰的發生、發展中發揮了重要的作用。還有研究[16]發現腎臟缺血/再灌注引起的急性腎功衰與腎小管上皮細胞的焦亡有關。我們在前期研究[17]中也發現體外培養的心肌細胞的缺氧/復氧損傷與心肌NLRP3介導的細胞焦亡密切相關。另外，相關的研究[18]也表明，NLRP3與細胞焦亡有關。然而，焦亡在心肌缺血/再灌注損傷中是否同樣發揮了作用仍然不清楚。在本研究中，我們建立了心肌缺血/再灌注損傷的動物模型，發現缺血/再灌注后心肌細胞中Tunel染色陽性率明顯升高，同時發現NLRP3炎癥小體、caspase-1、IL-1β及GSDMD-N的表達也顯著升高，說明缺血/再灌注可以引起心肌焦亡性細胞死亡；還發現caspase-1特異性抑制劑Z-YVAD-FMK抑制缺血/再灌注誘導的心肌細胞焦亡可以減輕心肌缺血/再灌注損傷；最后發現NLRP3抑制劑MCC950可以抑制缺血再灌注引起的心肌細胞焦亡。

正常的細胞受到死亡性刺激后會啟動一系列的分子機制最終導致細胞死亡[19]。除了常見的凋亡和壞死之外，還有很多其他形式的細胞死亡，如自噬、細胞焦亡、細胞脹亡、焦亡性壞死和壞死性凋亡等[20-21]。目前，心肌缺血/再灌注損傷的機制主要集中在鈣超載、氧化應激以及細胞的凋亡和壞死和自噬。細胞焦亡在心肌缺血/再灌注損傷中的作用鮮有研究。我們的研究結果表明，心肌的缺血/再灌注損傷部分是由其誘導的焦亡引起的。這一發現拓展了我們目前對心肌缺血/再灌注損傷的認識，并為以后制定減輕心肌缺血/再灌注損傷提供新的靶點依據。

炎癥反應在許多疾病，尤其是動脈粥樣硬化的發生和發展過程中扮演著極其重要的作用。缺血/再灌注可引起許多細胞和組織產生促炎性細胞因子。然而缺血/再灌注誘導的炎癥反應的內在機制目前尚不完全清楚。根據我們的研究可知，缺血/再灌注誘導的細胞焦亡可能是其促炎性反應的重要內在機制。與Caspase-3依賴的細胞凋亡不同的是，細胞焦亡依賴于一種重要的促炎性絲氨酸蛋白酶Caspase-1的活化。一旦Caspase-1活化，便會裂解促炎性細胞因子的前體(如pro-IL-1β和pro-IL-18)為其成熟體(IL-1β和IL-18)，并將其釋放到細胞外[22-23]。另外，細胞焦亡過程中細胞膜孔的形成將泄露胞質內容物(如DAMPs)，進而伴隨大量促炎性細胞因子的產生[24]。我們設想，細胞焦亡可能是缺血/再灌注誘導的心肌細胞死亡和心肌組織炎癥反應機制之一。

細胞焦亡依賴于炎癥小體調控的caspase-1的活化。根據亞基組成的不同，炎癥小體可分為多種，其中，NLRP3炎癥小體最具特色，并且研究得最為廣泛[25-26]。缺血/再灌注可以引起心肌細胞內NLRP3炎癥小體活化從而激活caspase-1，但是，是否缺血/再灌注誘導的心肌細胞焦亡就是由NLRP3炎癥小體活化介導的還尚需進一步證實。因此，我們通過MCC950來抑制NLRP3炎癥小體的表達后進行研究發現，抑制NLRP3表達可以有效抑制缺血/再灌注誘導的caspase-1的活化、細胞膜孔的形成以及心肌壞死。這一結果充分說明，NLRP3炎癥小體在缺血/再灌注誘導的心肌細胞焦亡的過程中發揮了重要的作用。

4 結論

心肌細胞焦亡在心肌缺血/再灌注損傷發生中發揮了重要的作用，其與NLRP3炎癥小體有關；抑制NLRP3炎癥小體的激活可以減少細胞焦亡，從而減輕心肌缺血/再灌注損傷。