miR-1275通過靶向IGF-1R基因對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響及作用機制*

惠明朗 姜翠菊 邱海濤 劉磊峰

(1.廣東醫科大學附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 湛江 524000；2.深圳市中西醫結合醫院耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518104)

鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，近年的發病率逐年升高，目前鼻咽癌治療手段以放療結合藥物為主，雖能對局部有較好的控制，但一部分患者在4年內仍會發生遠處轉移，一旦出現轉移，預后極差[1-2]。因此，探討有效的鼻咽癌治療方法尤為重要。miR-1275是miRNAs家族一員，其可靶向HOXB5抑制鼻咽癌細胞增殖，阻滯細胞周期[3-4]，但miR-1275對鼻咽癌細胞凋亡及機制影響尚未明確。胰島素樣生長因子1受體(Insulin like growth factor 1 receptor，IGF-1R)是一種酪氨酸激酶跨膜蛋白，參與細胞增殖、侵襲、凋亡、分化等一系列病理生理過程。目前研究[5-7]證實，在鼻咽癌、乳腺癌、結直腸癌等多種腫瘤中IGF-1R存在過表達，其異常活化可促進腫瘤增殖，抑制腫瘤細胞凋亡，介導細胞的遠處轉移。miR-1275是否可調節IGF-1R影響鼻咽癌細胞增殖、凋亡尚未清楚。本研究以鼻咽癌HONE-1細胞為研究對象，旨在探討miR-1275和IGF-1R對鼻咽癌細胞增殖、凋亡的影響及機制，為鼻咽癌診療提供新的研究靶點。

1 材料方法

1.1 試劑和儀器 人鼻咽癌細胞株HONE-1購自美國ATCC，FBS、RPMI 1640培養基、雙抗均購自美國Gibco，miR-1275 mimics、對照miR-NC、miR-1275 inhibitor、對照anti-miR-NC、IGF-1R特異性siRNA及陰性對照均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，Opti-MEM培養基、LipofectamineTM2000試劑盒均購自美國Invitrogen公司，Trizol、MTT試劑盒、PCR儀、酶標儀均購自美國Thermo公司，細胞凋亡試劑盒、流式細胞儀均購自美國BD，IGF-1R、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)、細胞增殖核抗原(PCNA)和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)抗體及HRP標記的二抗均購自美國Abcam。

1.2 細胞培養及瞬時轉染 細胞在5 %體積分數CO2、飽和濕度及37 ℃恒溫條件下，使用含有10 % FBS的RPMI 1640培養基培養。整個培養過程保證無菌操作，每2～3 d換液一次。取生長狀態良好的細胞，以2×105個/孔接種于6孔板，使用無血清及雙抗的培養基培養，細胞達60%左右生長密度時進行miR-1275 mimics(miR-1275組)、對照miR-NC、miR-1275 inhibitor(anti-miR-1275組)、對照anti-miR-NC、IGF-1R特異性siRNA(si-IGF-1R組)、陰性對照(si-NC組)、si-IGF-1R+anti-miR-1275的轉染，轉染過程嚴格按照LipofectamineTM試劑盒說明操作。細胞培養24 h后，將經Opti-MEM培養基稀釋的脂質體2000及質粒載體加入6孔板相應的孔內，于培養箱內常規培養，6 h后添加含雙抗及血清的培養液繼續培養48 h，用于后續實驗研究。

1.3 qRT-PCR實驗 Trizol法提取細胞總RNA，分光光度計檢測其純度及濃度，逆轉制備cDNA。依據試劑盒說明，以U6作為內參進行PCR擴增檢測。引物序列如下：miR-1275正向引物5′-GAACCTGGTA GTGGGGGAGA-3′，反應引物 5′-GTGCAGGGTCC GAGGTATTC-3′；U6 正向引物 5′-CTCGCTTCGG CAGCACA-3′，反應引物 5′-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3′。反應體系為20 μL，其中 SYBR Green Mix 10 μL，正向引物0.5 μL，反應引物0.5 μL，cDNA溶液2 μL，ddH2O 7 μL。反應程序為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。采用2-△△Ct公式計算miR-1275基因相對表達水平。設置5個復孔，實驗重復3次。

1.4 MTT比色實驗 以5×103/孔將生長至對數期的細胞接種于96孔板，常規培養24 h后進行轉染，分別于轉染的24、48和72 h在每孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL)，每個時間段設置5個復孔，常規培養4 h，加入150 μL DMSO終止反應。酶標儀測定波長為490 nm的光密度值(OD)。實驗重復3次。

1.5 流式細胞術細胞凋亡實驗 采用Annexin V-FITC/PI雙染法聯合流式細胞術檢測各轉染組細胞凋亡率。以5×104個/孔密度接種HONE-1細胞于細胞培養板中，常規培養24 h后進行轉染，收集轉染48 h的細胞，PBS洗滌細胞3次，結合緩沖液重懸細胞，每孔細胞中加 Annexin V-FITC和PI各5 μL，混勻，室溫避光反應10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 Western blot檢測蛋白水平 收集轉染48 h的各組細胞，細胞中添加適量RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度及純度。總蛋白與上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸變性，按照40 μg/孔上樣，經SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉法將蛋白條帶轉至PVDF膜。膜置于5%脫脂奶粉中封閉1 h，添加1∶1000稀釋的IGF-1R、t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3一抗，4 ℃孵育過夜，隨后加HRP標記的1∶2000稀釋的二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜。ECL化學發光液顯色，凝膠成像設備觀察結果，Image J軟件定量分析蛋白條帶灰度值。實驗重復3次。

1.7 miR-1275和IGF-1R靶向關系驗證 靶基因預測軟件顯示miR-1275和IGF-1R有結合位點。擴增IGF-1R基因的3'UTR片段，將miR-1275與IGF-1R結合部位的野生型(WT)及突變型(MUT)序列插入到螢火蟲熒光素酶基因下游構建表達載體。將miR-1275 mimics與WT/MUT重組質粒與脂質體2000混勻后轉染HEK 293T細胞，轉染48 h后，依據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-1275可抑制HONE-1細胞活力及誘導細胞凋亡 qRT-PCR、MTT實驗及流式細胞術細胞凋亡實驗結果顯示，與空白組比較，轉染miR-1275 mimics的HONE-1細胞miR-1275 基因表達水平明顯升高，細胞增殖活力明顯降低，細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；空白組與miR-NC組的miR-1275表達、細胞增殖活力及凋亡率差異均無統計學意義(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 過表達miR-1275后HONE-1細胞增殖、凋亡率的影響

表1 過表達miR-1275后HONE-1細胞miR-1275表達及細胞增殖、凋亡率變化

2.2 miR-1275對HONE-1細胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達的影響 Western blot檢測各組細胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達結果顯示，與空白組比較，轉染miR-1275 mimics的HONE-1細胞p-AKT和PCNA水平明顯降低，cleaved caspase3水平明顯升高(P<0.05)，3組t-AKT水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.3 miR-1275靶向下調IGF-1R表達 靶基因預測軟件顯示IGF-1R是miR-1275的潛在靶基因。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，過表達miR-1275可明顯抑制IGF-1R野生型熒光素酶活性(P<0.05)，而對IGF-1R突變型熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，見表2；Western blot結果顯示，過表達miR-1275可明顯抑制HONE-1細胞IGF-1R水平，而抑制miR-1275表達后細胞IGF-1R水平增加(P<0.05)，見圖3。

圖2 miR-1275對HONE-1細胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達的影響

圖3 miR-1275和IGF-1R結合位點及上調及下調miR-1275表達后IGF-1R表達變化

2.4 miR-1275通過上調IGF-1R促進HONE-1細胞增殖及抑制細胞凋亡 Western blot檢測結果顯示，與si-NC組比較HONE-1細胞轉染IGF-1R siRNA后，IGF-1R水平降低，細胞增殖活力降低，凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)；將si-IGF-1R與miR-1275抑制物共同轉染至HONE-1細胞后，與 si-IGF-1R+anti-miR-NC組比較，IGF-1R水平明顯升高，細胞增殖能力明顯升高，凋亡率降低(P<0.05)，見圖4。

表2 雙熒光報告基因實驗檢測各轉染組細胞雙熒光素酶活性

圖4 miR-1275通過上調IGF-1R促進HONE-1細胞增殖及抑制細胞凋亡

2.5 miR-1275靶向IGF-1R對HONE-1細胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達的影響 Western blot檢測各轉染組細胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達結果顯示，與si-NC組比較，si-IGF-1R組p-AKT和PCNA水平明顯降低，cleaved caspase3水平明顯升高(P<0.05)；與si-IGF-1R+anti-miR-NC組，si-IGF-1R+anti-miR-1275組p-AKT和PCNA水平明顯升高，cleaved caspase3水更新明顯降低(P<0.05)，4組細胞t-AKT水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5。

圖5 Western blot檢測各轉染組細胞t-AKT、p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達

3 討論

microRNAs(miRNAs)是一類非編碼的小分子RNA，可通過與靶mRNA的3'-UTR直接作用來調節生物體內的生物學過程[8]。多項研究[9-10]表明，miRNAs在腫瘤細胞生長、分化、凋亡、生命體發育等過程中發揮癌基因或抑癌基因樣作用，這預示著miRNAs可能成為腫瘤診療的生物標志物。有研究[11]顯示， miR-1275可通過調節LZTS3促進肺癌細胞增殖和轉移；LncRNA miR143HG可通過miR-1275/AXIN2 分子軸抑制膀胱癌發展[12]。既往研究[3-4]表明，鼻咽癌中miR-1275表達降低，過表達miR-1275可抑制鼻咽癌細胞增殖及阻滯細胞周期。本研究結果顯示，過表達miR-1275可抑制鼻咽癌HONE-1細胞增殖，促進細胞凋亡。但miR-1275調控鼻咽癌具體機制還需進一步探究。

IGF-1R已被證明在一些惡性腫瘤生長、增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程中發揮關鍵作用，其過度表達已成為多種惡性腫瘤細胞的普遍特征[13-14]。因此，IGF-1R是一個有前景的腫瘤治療靶點[15-16]。有研究[17]顯示，miR-1275可通過靶向IGF2BP1、IGF2BP3和IGF-1R三種IGF2 mRNA結合蛋白抑制肝癌細胞生長。本研究通過生物信息學軟件發現miR-1275和IGF-1R有結合位點，并通過Western blot證實miR-1275可負向調控IGF-1R的表達。進一步的細胞增殖、凋亡實驗顯示，抑制IGF-1R表達可降低HONE-1細胞增殖，促進細胞凋亡，而同時抑制IGF-1R和miR-1275表達可減弱抑制IGF-1R對細胞增殖、凋亡的影響。提示miR-1275可靶向調節IGF-1R影響鼻咽癌細胞增殖及凋亡。

PI3K/AKT信號通路是一條重要的信號通路，可調控腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移及凋亡過程，對腫瘤演進、預后發揮重要作用[18-19]。PI3K/AKT信號在多種腫瘤中表達失調，主要原因是AKT過度活化。AKT是一種原癌基因，是PI3K下游的直接靶蛋白，AKT活化可通過調節下游mTOR、PCNA、caspase3等靶基因，經過多種途徑促進細胞存活[20-21]。IGF-1R可結合于IGF和IGF2配體，活化細胞內酪氨酸激酶，促進細胞G1/S期轉化，啟動PI3K/AKT信號通路，進而促進細胞增殖及腫瘤惡化[22]。抑制IGF-1R/PI3K/AKT信號通路可明顯減弱鼻咽癌細胞生長[23]。本研究結果顯示，過表達miR-1275及抑制IGF-1R均可明顯下調p-AKT和PCNA水平，上調cleaved caspase3水平，而抑制miR-1275表達可減弱抑制IGF-1R對p-AKT、PCNA和cleaved caspase3表達的影響。

4 結論

過表達miR-1275可抑制鼻咽癌HONE-1細胞增殖，促進細胞凋亡，抑制AKT信號途徑。IGF-1R是miR-1275的靶基因，miR-1275可靶向IGF-1R并調控AKT信號途徑影響鼻咽癌細胞增殖和凋亡，miR-1275/IGF-1R分子軸可能成為鼻咽癌治療的重要靶點。