細胞自噬參與中性粒細胞胞外誘捕網形成的機制研究進展*

楊冬梅 綜述 邢艷 審校

(川北醫學院醫學檢驗系·轉化醫學研究中心，四川 南充 637000)

中性粒細胞胞外誘捕網(Neutrophil extracellular traps，NETs)是由中性粒細胞解體后釋放的DNA、組蛋白及胞漿蛋白形成的網狀結構，是固有免疫系統抵抗感染的重要屏障[1]。NETs形成包括三個關鍵因素：活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產生、組蛋白瓜氨酸化及自噬激活。現有研究已經基本闡明ROS和組蛋白參與NETs形成的機制，而自噬依賴的NETs形成機制近期才受到關注。細胞自噬是一種程序化的胞內降解過程，主要依賴溶酶體降解自身胞質成分而實現細胞自身代謝和細胞器更新，以維持細胞內環境穩態。深入研究發現細胞自噬和中性粒細胞的多種功能有著密切關聯，包括中性粒細胞脫顆粒、ROS產生和中性粒細胞胞外誘捕網形成等[2]。本文對中性粒細胞自噬參與NETs形成機制進行綜述，以期為揭示相關疾病的發病機制以及探索藥物作用靶點提供參考依據。

1 中性粒細胞胞外誘捕網

中性粒細胞是人體最豐富的固有免疫細胞，被稱為宿主防御的“前鋒”，在疾病發生、進展及預后過程中起關鍵作用。2004年，Brinkmann等[3]首先發現用IL-8、佛波肉豆蔻酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)或脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激中性粒細胞后，會釋放一種網狀結構，將其稱為NETs。釋放NETs過程被稱為“NETosis”，包括三種類型：①自殺式NETosis，該過程持續2～4 h，主要依賴Raf/MERK/ERK 信號轉導通路激活、肽基精氨酸酶脫氨酶4(PAD4)介導的組蛋白瓜氨酸化以及大量ROS產生[4-5]，導致核染色體解聚，其中NADPH氧化產生的ROS是觸發NETs形成的必要中間體。②依賴細胞核DNA釋放式NETosis，又稱“真實NETosis”，該過程需5～60 min，不依賴于ROS產生和 Raf/MERK/ERK 信號通路激活，而受Toll樣受體、補體C3和血小板等影響[6]，中性粒細胞通過囊泡形式，將解旋的染色體和組蛋白釋放到胞外組裝成NETs[7]。③依賴線粒體DNA釋放式NETosis，中性粒細胞在補體C5a、LPS等刺激下，快速釋放線粒體DNA參與形成NETs，該過程主要依賴線粒體ROS產生[8-9]。研究[10-13]發現缺氧、過敏、IL-1等因素可通過調控自噬/REDD1、RIPK3/MLKL及PAD4等信號途徑，使得中性粒細胞核膜和大量顆粒膜破裂，釋放中性粒細胞彈性蛋白酶、髓過氧化物酶；同時煙酰胺腺嘌呤(NADPH)氧化產生大量ROS，PAD4介導組蛋白瓜氨酸化等，進一步誘導形成NETs[14]。

NETs具有捕獲、殺死和清除各種微生物，包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲的作用。然而，當體內中性粒細胞釋放NETs過多，如果不能及時被清除，將作為自身抗原參與破壞機體免疫耐受而誘發自身免疫性疾病，如類風濕性關節炎和ANCA相關性血管炎等[15-16]。此外，NETs還能介導組織因子驅動血栓形成，導致急性心肌梗死[17]等。

2 自噬

自噬，又稱“自食”，是細胞在能量供應不足時通過消化自身代謝廢物來回收營養物的生存機制。自噬始于半圓形膜雙層結構逐漸內陷，包裹需要降解的代謝廢物，逐漸形成封閉的自噬小體，再與溶酶體融合形成自溶體，將消化的內容物釋放到細胞質中用于生物合成，又稱“自噬流”。自噬體是由一些自噬相關基因(ATG)表達的蛋白組成的復合體，包括Atg5、Atg12、Atg6(beclin-1)、Atg8和Atg12等，其形成過程為Atg5與Atg12結合形成復合物后，募集游離的LC3(ATG8)與之形成共軛復合物，靶向定位在空泡膜上形成自噬小體，再與Atg6-Atg14L-VPS復合物結合形成自噬前體復合物(UKL)[18-20]。ULK主要受哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)負調控，其上游又包括AMPK、PI3K/Akt和MAPK/ERK等多條通路。多種因素通過影響這些信號通路實現對自噬的調控，如生長因子、胰島素等通過PI3K-Akt信號軸激活mTOR，抑制自噬；應激、營養不足條件下經AMPK抑制mTOR，上調自噬，這在很多代謝性疾病和腫瘤相關研究中得到證實[21-23]。自噬信號通路調控機制見圖1。

自噬具有“雙向”作用，可發揮保護性作用或損害性作用。自噬平衡對機體抵抗病原體入侵、調節抗原遞呈參與適應性免疫反應至關重要，當自噬失衡，入侵的病原體和損傷的細胞器不能被完全清除，可能誘發自身免疫性疾病。因而體內恰當水平的自噬是機體維持正常生理功能的前提。有研究[24]指出中性粒細胞自噬在調控NETs形成中發揮重要作用，自噬激活加速NETs形成，早期或中晚期自噬抑制劑可抑制NETs釋放，這充分證明自噬與NETs形成之間存在必然聯系。

圖1 自噬信號通路圖

3 自噬與NETs

mTOR是自噬調節的重要節點，自噬被活化或是抑制，取決于mTOR上游的作用因子，抑制mTOR信號軸，促進中性粒細胞自噬的同時加速了NETs形成，說明自噬和NETs形成具有協同關系。自噬參與NETs形成受多種機制調控。

3.1 細菌衍生肽作用機制 中性粒細胞可以響應內外環境中各種刺激，包括炎癥因子、細胞因子和微生物組分，常見如細菌衍生肽(N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine, fMLP)、LPS等[25-26]。在中性粒細胞中，fMLP通過與特異性G蛋白偶聯受體(主要是甲酰肽受體，FPR)結合，調控下游mTOR信號分子，介導自噬參與NETs形成。Itakura等[24]發現當利用特異性自噬誘導劑雷帕霉素處理中性粒細胞，自噬、NETs水平均明顯升高；在雷帕霉素和fMLP共處理下，中性粒細胞自噬水平降低，同時NETs形成速率明顯減慢，表明fMLP可抑制雷帕霉素作用下的自噬激活及NETs形成，fMLP-FPR-mTOR信號軸在介導自噬參與NETs形成中發揮重要作用。此外，fMLP-mTOR信號軸還能通過影響組蛋白瓜氨酸化影響NETs形成，該過程也需要自噬參與。當中性粒細胞受到各種炎癥刺激后，核膜破裂，染色體裂解成組蛋白及DNA，釋放到胞漿中，經PAD4介導的瓜氨酸化的組蛋白是NETs的關鍵結構蛋白[27]。Itakura等[24]也發現雷帕霉素誘導自噬激活的同時組蛋白H3(H3Cit)表達上調，而fMLP能抑制雷帕霉素誘導下的自噬水平，同時降低組蛋白H3(H3Cit)表達，導致NETs形成速率減慢，表明自噬可通過影響組蛋白瓜氨酸化參與NETs形成，該過程受fMLP- mTOR信號軸負調控。微管、肌球蛋白、肌動蛋白是細胞骨架的重要組成部分，不僅參與形成NETs的結構骨架，也有利于自噬小體形成及溶酶體融合[28-29]。研究[30]發現激活mTOR能通過介導肌動蛋白細胞骨架動力學抑制黑素瘤細胞自噬水平，同時抑制NETs形成。由此可見，mTOR信號分子在自噬依賴的NETs中發揮重要作用。

3.2 PI3K分子作用機制 磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是重要的信號分子，其中參與調控自噬主要有Ⅰ類PI3K(PI3K-1)和Ⅲ類 PI3K(PI3K-3)。體內胰島素可激活磷脂酰肌醇3激酶1(PI3K-1)，使蛋白激酶(AKT)磷酸化，并與之形成PI3K-1-Akt復合物，該復合物可以進一步促進腫瘤抑制因子TSC2磷酸化，TSC2磷酸化是激活mTOR的先決條件之一[31]，mTOR通過抑制ULK從而阻礙自噬啟動[32]。PI3K-3參與亮氨酸激活mTOR信號通路，當體內亮氨酸濃度升高，激活mTOR，抑制自噬發生[33]。上文中我們已經總結了mTOR調控自噬參與NETs形成的關鍵作用，因而推測PI3K-1和PI3K-3可以通過mTOR信號分子調控自噬參與NETs形成。此外，在mTOR下游，哺乳動物中的PI3K-3(Vps34)，與Vps15、Beclin -1結合形成復合體[34]，該復合物主要結合Atg14，參與形成自噬泡。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)，通過抑制VPS34能有效降低ANCA相關性血管炎患者中性粒細胞自噬水平和NETs，推測ANCA患者體內NETs形成過程依賴自噬，并受PI3K-3調控[35]。Ma等[36]也發現用急性早幼粒細胞白血病(APL)患者血漿刺激中性粒細胞后，NETs明顯增加，而自噬抑制劑3-MA作用后可明顯降低該效應，表明APL誘導的NETs形成依賴PI3K-3介導的自噬。然而，Germic等[37]的研究否認了這一結論，該研究發現3-MA僅能消除暴露于低濃度的PMA介導的NETs水平，而對雷帕霉素刺激下的NETs形成無抑制作用，推測3-MA抑制NETs形成是通過抑制ROS產生，該過程依賴PI3K-1活性[38]，而不依賴自噬，3-MA不僅可以阻斷PI3K-3抑制自噬，也能阻斷PI3K-1活化、降低NADPH氧化酶活性使NETs形成減少。

3.3 自噬基因調控機制 自噬受多種基因調控，目前已經鑒定出約71種自噬基因[39]，以ATG1、5、6、7、8、12最為重要。近期研究發現部分自噬基因也參與調控NETs形成。Xu等[40]通過動物研究發現成年鼠中TLR樣受體2(Toll-like receptor 2)誘導的NETs形成減少依賴于低水平的ROS和自噬，其中ATG5基因缺陷是自噬參與NETs形成減少的主要原因，當敲低鼠中性粒細胞中的ATG5基因，自噬活性明顯降低且NETs形成速率明顯減慢；該研究還發現成年鼠中NETs形成減少而凋亡增加可能是自噬調控的結果。然而，另一研究[41]發現在急髓白血病M3細胞株(HL-60)中過表達ATG5，能明顯促進ROS產生，但對自噬和NETs形成均無明顯上調或抑制作用，提示ATG5依賴的NETs可能受細胞類型差異影響。Ma等[36]的研究也發現利用小干擾RNA(siRNA)敲低自噬基因ATG7，幾乎完全消除了APL血清誘導下的自噬，并抑制了NETs 形成，表明APL血清誘導的NETs 形成可能也依賴自噬基因ATG7。ATG1(ULK1)調控NETs形成受mTOR 信號通路上游刺激影響在前文中已經闡明，其他特異性自噬基因是否參與NETs形成有待進一步考證。

3.4 PMA/REDD1作用機制 PMA，經典NETs誘導劑，誘導NETs形成機制主要依賴ROS產生。研究指出自噬也參與了PMA誘導的NETs形成。Remijsen等[42]發現利用PMA刺激中性粒細胞后，雙分子層自噬囊泡和自噬標志性蛋白LC3均明顯增多，同時伴隨ROS產生增多；抑制自噬，ROS產生降低，NETs形成減少，而抑制ROS產生同樣阻礙自噬體形成，表明ROS產成和自噬激活之間存在密切的相互依賴關系，ROS產生介導自噬，反過來，ROS產生也依賴于自噬。ROS產生和自噬激活是PMA誘導的NETs的必要因素，缺一不可，無論抑制自噬或者NADPH氧化，都阻礙了染色體裂解，抑制NETs形成。Wang等[43]研究也發現利用阿特拉津(Atrazine，ATR)，一種選擇性的除草劑，體外刺激鯉魚中性粒細胞，能抑制ROS產生和自噬激活，明顯降低PMA誘導的NETs形成水平，而該效應能被雷帕霉素逆轉，再次印證PMA誘導的NETs形成可能依賴于自噬。DNA損失反應蛋白1(REDD1)，同樣在自噬依賴的NETs中發揮重要作用。研究[4]報道在家族性地中海熱患者外周血PMNs中REDD1表達明顯上調，促進NETs釋放，該過程依賴自噬激活。Frangou等[44]研究發現缺氧誘導因子1ɑ(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和內皮素-1誘導SLE患者中性粒細胞REDD1表達上調，激活REDD1/自噬途徑，使得NETs釋放增加。同樣，另一研究[45]也發現潰瘍性結腸炎(UC)患者中NETs形成增多依賴自噬，并與中性粒細胞中REDD1表達增高有關，REDD1/自噬/NETs軸參與了UC患者體內IL-1β驅動的炎癥反應。

3.5 其他調節機制 研究[46]發現C型凝集素(Mincle)缺陷的中性粒細胞中NETs形成減少，自噬體激活受損，而ROS產生不受影響，通過自噬誘導劑他莫昔芬外源性干預Mincle-的中性粒細胞，能逆轉Mincle-中性粒細胞中NETs形成缺陷，推測Mincle介導的NETs形成依賴自噬而不是ROS形成。此外，Zhou等[47]報道貝氏芽孢桿菌能誘導AMPK磷酸化，促進自噬體形成，同時NETs形成增加，提示自噬依賴的NETs可能受AMPK調控。另一項研究[48]發現用鄰苯二甲酸二酯(DEHP)體外干預鯉魚中性粒細胞后，可檢測到大量ROS產生，NETs形成明顯增多，自噬自噬蛋白mTOR表達降低、Atg6、LC3表達升高，推測DEH誘導的NETs形成是ROS和自噬共同作用的結果。綜合上述研究，充分證實了自噬在NETs形成中的重要作用。自噬參與NETs形成信號調控見圖2。

圖2 自噬參與NETs形成信號調控圖

4 小結

細胞自噬和NETs形成具有協同作用，NETs形成依賴于細胞自噬，其參與NETs形成的機制可能涉及到多種因素調控。鑒于兩者在多種疾病中發揮重要作用，對其相互作用機制的深入研究或將為疾病診斷、臨床治療提供新思路。