LM609聯合TBBPA對斑馬魚神經行為毒性的影響

李佳妮，陳將飛，董昊嘉，王紅珠，史清玉，喻家健，黃長江

(溫州醫科大學，浙江 溫州 325000)

四溴雙酚A(TBBPA)是一種廣泛使用的溴代阻燃劑[1]，常被應用于各種塑料制品，在日常生活中常有添加，如母嬰制品、工業制品等，在環境中有較高劑量的存在[2]。有研究表明，TBBPA在使用及降解過程中對水源、空氣等環境造成污染，從而間接進入人體，極微小的劑量就可引起毒性反應，引起生物體的神經毒性，且毒性效應會根據發育時期的不同而改變，但其毒性機制尚不明確。研究發現，TBBPA是甲狀腺激素(T4，四碘甲狀腺原氨酸)的結構類似物[3]。T4是一種氨基酸衍生物，在生物體遭受刺激時，下丘腦釋放促甲狀腺激素釋放激素(TRH)刺激垂體，垂體前葉收到刺激產生促甲狀腺激素(TSH)，TSH進一步刺激甲狀腺釋放T4，T4通過αVβ3信號通路發揮作用[4]。因此，有學者認為，當TBBPA進入生物體后，會與T4受體競爭性結合，影響αVβ3信號通路，使得該信號通路紊亂，影響機體正常的生命活動。在動物體內，Anti-Integrin αVβ3 抗體(LM609)是一種能阻斷αVβ3整合素與纖維黏連素結合的抗體[5]，能夠在一定程度上阻斷αVβ3信號通路，因此，我們猜想LM609的添加可在一定程度調節因TBBPA導致的αVβ3信號通路的紊亂，挽救TBBPA的神經毒性。

斑馬魚是一種新型的模式生物，相比于嚙齒動物而言，斑馬魚具有體型小、易繁殖的特點。斑馬魚的胚胎在體外發育，易觀察易操作，可實時記錄斑馬魚胚胎發育的動態過程，適合進行多種體外實驗，且目前斑馬魚的實驗技術均已成熟，如斑馬魚胚胎行為學實驗、斑馬魚胚胎顯微注射[6]、斑馬魚基因突變體構建[7]等。因此，斑馬魚在毒理學研究、神經行為學研究等方面均有卓越的優勢。在本實驗中，我們進行了斑馬魚自主運動實驗、接觸反應實驗、光暗周期實驗，以比較LM609添加前后TBBPA的毒性效應，從而評價LM609與TBBPA聯合暴露對斑馬魚胚胎的神經毒性影響，進而明確TBBPA進入生物體產生毒性的機制是否與αVβ3信號通路有關[8]。通過本研究，可以為溴代阻燃劑的合理使用提供指導，也為溴代阻燃劑造成的臨床疾病治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗所用斑馬魚為來自美國俄勒岡州立大學斑馬魚實驗室的野生型AB品系斑馬魚，飼養于全封閉式水循環系統，光暗周期設置為14 h光照、10 h黑暗，喂食孵化完全的豐年蟲，每日2次，每次間隔12 h左右，20 d齡以下的幼魚喂食專用的幼魚飼料[9]。

1.1.2 實驗試劑

本研究所用試劑主要有純度為100%的Anti-Integrin αVβ3 抗體(LM609)(Ab190147，Abcam)，純度≥99%的TBBPA(分子量為543.87 u，79-94-7，Aldrich)，分析純的二甲基亞砜(DMSO)(分子量為78.12 u，67-68-5，上海展云化工有限公司)。

1.1.3 實驗儀器

全封閉式斑馬魚循環系統Aquatic Habitats Stand-Alone System(美國AHAB公司)；斑馬魚光照恒溫胚胎培養箱(RXZ-300C，寧波江南儀器廠)；體式顯微鏡(Nikon SMZ1500，上海千欣儀器有限公司)。

1.2 實驗試劑的配制

實驗藥品的配制：使用1×PBS緩沖液將LM609稀釋至50 μg·mL-1工作液，以酚紅為指示劑用于顯微注射；TBBPA先用DMSO配制2 mmol母液，使用時將其稀釋1 000倍即為2 μmol工作液；對照組使用千分之一濃度的DMSO處理。

胚胎培養液(EM)的配制：稱取0.8 g NaCl，0.04 g KCl，0.003 58 g Na2HPO4，0.006 g KH2PO4，0.144 g CaCl2，0.246 g MgSO4·7H2O，0.35 g NaHCO3，800 mL超純水置于1 L燒杯中，超聲攪拌至澄清，再用超純水定容至1 L，滴加1 mol NaOH溶液調pH至7.2即可。

1.3 斑馬魚胚胎的收集及前期處理

提前2～3 d對斑馬魚雌雄分缸喂養并加餐，在收集斑馬魚胚胎的前一晚，按照雌魚∶雄魚1∶1的比例將斑馬魚分別放置于孵化框中，避光放置并插好擋板，第二日早上10點將擋板拔掉，并將孵化框置于陽光處，雄魚將追尾雌魚進行交配，約20 min后交配結束，收集胚胎。將胚胎用胚胎培養液清洗3遍后，挑出狀態不好的胚胎，其余胚胎置于胚胎培養箱中培養，每日檢查胚胎狀態，及時將死亡胚胎挑出，并更換新的培養液。

1.4 斑馬魚胚胎顯微注射LM609

在收集并清洗斑馬魚胚胎后，在顯微鏡下及時挑選出健康的胚胎，1 h內的胚胎為單細胞期，挑選單細胞期的斑馬魚胚胎，將其逐個排列在顯微注射板上，用于顯微注射。顯微注射使用6 μL體系，即酚紅指示劑1 μL與5 μL的LM609工作液，混勻后將其注射至斑馬魚胚胎的卵黃囊中，在顯微鏡下可明顯觀察到斑馬魚胚胎卵黃囊部分有淡紅色暈塊即為注射成功。10 min后在顯微鏡下觀察，挑出狀態不好及死去的斑馬魚胚胎，剩余斑馬魚胚胎置于添加1‰雙抗的胚胎培養液中培養。

1.5 斑馬魚胚胎暴毒及神經行為實驗

1.5.1 斑馬魚胚胎暴毒

設置對照組、2 μmol TBBPA暴露組、50 μg·mL-1LM609暴露組、TBBPA聯合LM609暴露組共4組，前2組使用野生型斑馬魚胚胎進行暴毒，后2組使用注射LM609的斑馬魚胚胎進行暴毒，暴毒窗口設置為8～48 hpf(hours post fertilization，受精后小時數)。在斑馬魚胚胎半胞期即8 hpf時進行暴毒，將發育健康的野生型斑馬魚胚胎和顯微注射LM609的斑馬魚胚胎分別置于6孔板中，每孔30枚胚胎，每組設置3個孔即為3個重復，每孔5 mL暴毒液，對照組則用1‰ DMSO作為對照，蓋好保鮮膜避免暴毒液的揮發，將其置于胚胎培養箱中培養。

胚胎于48 hpf時脫毒，將暴毒液吸出后用EM清洗3次，每孔加入5 mL EM后蓋上新的保鮮膜，置于胚胎培養箱中培養以待后續實驗。斑馬魚胚胎約在72 hpf時全部脫膜，及時將脫掉的胚胎膜挑出，待5 dpf(Days post fertilization，受精后天數)后將發育良好的斑馬魚仔魚轉移至容量為2 L的幼魚缸中飼養，每天喂食3次適量小魚飼料，及時觀察斑馬魚幼魚的發育狀態，并將死掉的仔魚挑出。

1.5.2 斑馬魚行為實驗

在18～24 hpf時，每2 h記錄各暴毒組斑馬魚胚胎的擺尾次數作為自主運動數據，每組記錄60條魚。

在48 hpf時，先將各組斑馬魚胚胎脫毒后，用鏈霉蛋白酶脫膜后，用針灸針輕輕觸碰斑馬魚仔魚的尾部，記錄其受到觸碰后的運動距離，作為斑馬魚的觸摸反應實驗數據。

斑馬魚光暗周期實驗挑選各組健康的、發育良好的、無肉眼可見畸形的斑馬魚仔魚進行，行為實驗使用ViewPoint Zebra-Lab行為儀[10]。斑馬魚幼魚5 dpf的運動速度實驗用24孔板，在屏幕上繪制出24個與孔板重合的大小形狀相同的圓形，24孔板每孔加入1.5 mL的超純水。每組挑選24條發育健康的活躍幼魚，用巴氏滴管轉移到上述的備好的24孔板中，每孔1條幼魚。將每個暴毒組都依次準備好并記錄，于光照恒定、溫度恒定(28 ℃)的安靜環境中適應20～30 min，于120 hpf(上午10點)開始實驗。

Tracking模式參數為：背景像素20 pixels；速度1.5～3.0 mm·s-1；每隔60 s數據輸出；程序光周期強度或持續光照強度為100%(500 1x)。每個程序設置為5 min光照、5 min黑暗、5 min光照、5 min黑暗、5 min光照，共計25 min。

1.6 數據分析

實驗中所有數據均使用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計分析及作圖。數據描述方法若無特殊說明，使用均值±標準差表示。數據先進行Shapira-Wikinson正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊則進行獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，若不符合正態分布或方差不齊，對數據進行Welch法近似t檢驗或非參數檢驗；當統計檢驗水平為P<0.05時，認為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 LM609聯合TBBPA暴露對斑馬魚胚胎自主運動的影響

LM609聯合TBBPA暴露至18～26 hpf時，對各組的斑馬魚胚胎進行了自主運動實驗(圖1)。18 hpf時，各組斑馬魚胚胎的自主運動次數趨近于0，與對照組相比，僅2 μmol TBBPA聯合50 μg·mL-1LM609暴毒組自主運動次數上調且有顯著性差異；2 μmol TBBPA暴毒組與50 μg·mL-1LM609暴毒組自主運動次數無顯著性差異。20 hpf時，較18 hpf斑馬魚胚胎自主運動次數增多(圖1中A)；2 μmol TBBPA暴毒組與對照組相比，自主運動次數顯著性上調；LM609暴露組斑馬魚胚胎的自主運動次數與對照組相比無顯著性差異；2 μmol TBBPA聯合50 μg·mL-1LM609暴毒組斑馬魚胚胎的自主運動次數與對照組相比無顯著性差異(圖1中C)。22 hpf時，較20 hpf斑馬魚胚胎自主運動次數增多(圖1中A)；2 μmol TBBPA暴毒組與對照組相比，斑馬魚胚胎的自主運動次數顯著上調；50 μg·mL-1LM609暴露組、2 μmol TBBPA聯合50 μg·mL-1LM609暴毒組斑馬魚胚胎的自主運動與對照組相比無顯著性差異(圖1中D)。24 hpf時，斑馬魚胚胎自主運動次數最多(圖1中A)；與對照組相比，2 μmol TBBPA暴毒組斑馬魚胚胎自主運動次數明顯上調且有顯著性差異；50 μg·mL-1LM609暴露組、2 μmol TBBPA聯合50 μg·mL-1LM609暴毒組自主運動次數增多，但與對照組相比均無顯著性差異(圖1中E)。26 hpf時，斑馬魚胚胎自主運動次數開始下調(圖1中A)；與對照組相比，2 μmol TBBPA暴毒組自主運動次數明顯上調且有顯著性差異；50 μg·mL-1LM609暴露組、2 μmol TBBPA聯合50 μg·mL-1LM609暴毒組自主運動次數稍多，但均無顯著性差異(圖1中F)。各暴毒組斑馬魚胚胎自主運動趨勢呈拋物線式，在24 hpf時各組斑馬魚胚胎自主運動次數均達到最高值，之后開始下調?？傮w而言，2 μmol TBBPA暴毒組斑馬魚胚胎自主運動次數明顯上調且有顯著性差異。自主運動的結果表明，聯合暴露組挽救了因TBBPA所造成的斑馬魚自主運動的增多，LM609對TBBPA的自主運動毒性效應具有挽救效應。

2.2 LM609聯合TBBPA暴露對斑馬魚接觸反應的影響

50 μg·mL-1LM609聯合TBBPA暴露至48 hpf時，對各暴毒組的斑馬魚胚胎脫膜后進行了接觸反應實驗，每組檢測24條魚。對照組斑馬魚仔魚的接觸反應距離達到(22.07±2.458)mm；2 μmol TBBPA暴毒組斑馬魚仔魚的接觸反應距離降低至(13.46±0.688)mm，與對照組相比具有顯著性差異；50 μg·mL-1LM609暴毒組斑馬魚仔魚的接觸反應距離上調，達到(22.27±2.391)mm，但是與對照組相比無顯著性差異；2 μmol TBBPA聯合50 μg·mL-1LM609暴毒組斑馬魚仔魚的觸摸反應距離上調為(25.74±2.541)mm，與對照組相比無顯著性差異(圖2)。結果表明，2 μmol TBBPA暴露導致斑馬魚仔魚的觸摸反應距離顯著下調，2 μmol TBBPA聯合50 μg·mL-1LM609暴毒則使得斑馬魚仔魚的觸摸反應距離上調，LM609對TBBPA所導致的接觸反應毒性作用具有挽救效應。

2.3 LM609聯合TBBPA暴露對斑馬魚運動速度的影響

50 μg·mL-1LM609聯合TBBPA暴露至48 hpf脫毒后，于EM中培養至5 dpf時，對各暴毒組的健康的斑馬魚仔魚進行了光暗周期的實驗，每組檢測24條魚。實驗結果發現，在光照情況下，對照組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.576±0.043 25)mm·s-1；2 μmol TBBPA暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.164±0.033 57)mm·s-1，與對照組相比顯著下調；50 μg·mL-1LM609暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.693±0.035 52)mm·s-1，與對照組相比無顯著性差異；2 μmol TBBPA聯合50 μg·mL-1LM609暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.490±0.041 47)mm·s-1，與50 μg·mL-1LM609單獨暴毒組相比顯著下調，與對照組相比無顯著性差異(圖3中A)。在黑暗情況下，各暴毒組斑馬魚仔魚的自由游泳速度均較光照情況上調，對照組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.938±0.033 96)mm·s-1，2 μmol TBBPA暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.736±0.032 02)mm·s-1，與對照組相比顯著性下調；50 μg·mL-1LM609暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.737±0.045 56)mm·s-1，與對照組相比顯著性下調；2 μmol TBBPA聯合50 μg·mL-1LM609暴毒組的斑馬魚仔魚自由游泳速度為(1.851±0.032 04)mm·s-1，與對照組相比無明顯差異，與50 μg·mL-1LM609單獨暴毒組相比上調(圖3中B)。所有的暴毒組在黑暗條件下的自由游泳速度均高于光照條件下的自由游泳速度，趨勢保持穩定。光暗周期實驗表明，聯合暴露能夠挽救TBBPA導致的斑馬魚光暗情況下自由游泳速度的下調，且在光照條件下挽救上調作用更加明顯。

18～26 hpf斑馬魚胚胎自主運動數據，檢測指標為斑馬魚胚胎在各個時間發育節點的擺尾次數；A—各組斑馬魚胚胎自主運動趨勢圖；B～F—各組斑馬魚胚胎在不同的時間發育節點擺尾次數；*—代表不同處理間有顯著性差異，不同處理間標有不同字母代表處理間有顯著性差異，P<0.05。圖2～3同。圖1 聯合暴露對斑馬魚胚胎自主運動的影響

圖2 48 hpf時斑馬魚仔魚接觸反應

A—斑馬魚僅在光照情況下的自由游泳速度；B—斑馬魚僅在黑暗情況下的自由游泳速度。圖3 5 dpf時斑馬魚仔魚自由游泳速度

3 討論

目前對于單獨化合物[11]的毒理學效應研究較多，但是對于其機制研究的較少，化合物進入機體內是以何種途徑轉化繼而發揮毒性效應的，這才是化合物暴露的研究重點。近年來，隨著斑馬魚胚胎顯微注射技術的不斷成熟，使得一些不易體外暴露產生效應的物質，如抗體、激素等，很容易就能注射到斑馬魚胚胎的卵黃囊內，繼而發揮效應。使得我們在研究化合物暴露的機體效應時，能夠將一些與化合物機體效應途徑相關的激素或者抗體等注射進入斑馬魚胚胎內，使其聯合暴毒，可能會對化合物在機體內的轉化效應產生干擾，以明確化合物的致毒機制[12]，以便后續為該化合物的治療提供思路和參考。

斑馬魚的自主運動主要是斑馬魚尾部的擺動[13]，與斑馬魚的次級神經元無關，是受到斑馬魚初級神經元支配的運動[14]，不依賴斑馬魚的腦部神經元，是可檢測的最早的神經行為[15]。觸摸反應也是如此。斑馬魚自主運動一般在19 hpf時開始，TBBPA暴毒導致胚胎自主運動次數明顯增多，接觸反應運動距離減少；LM609與TBBPA的聯合暴露則使得斑馬魚胚胎的自主運動和觸摸反應恢復到正常值，LM609對TBBPA的神經毒性效應具有挽救作用。

斑馬魚5 dpf的光暗周期實驗可以很準確的反應斑馬魚在光暗情況下的速度，是衡量斑馬魚肌肉及神經發育的一個很好的參數。實驗表明，TBBPA暴露導致斑馬魚在光暗情況下的速度均降低，經LM609與TBBPA聯合暴露后，斑馬魚的運動速度又恢復至正常值，挽救效應明顯。

LM609作為一種能夠阻斷T4作用途徑的抗體[16]，會使得機體內的甲狀腺激素含量降低；TBBPA作為T4的結構類似物，進入機體后則會與T4受體結合[17]，可能會導致機體內T4的含量上升。而本研究表明，就斑馬魚的神經行為而言，LM609能夠挽救因TBBPA所導致的毒性效應，則在一定程度上驗證了TBBPA進入機體內后，是通過升高機體內的甲狀腺激素含量發揮作用的。這就為后續治療TBBPA所導致的神經行為毒性提供了理論支撐，同時，LM609顯微注射的斑馬魚可作為一種T4研究的模式生物，也為甲狀腺相關的研究和治療提供了臨床依據。