甲硝唑藥物錳配合物的合成及與DNA的相互作用

楊莉?qū)?黑嘉慧,成 昭,苗延青

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西航天職工大學(xué)，陜西 西安 710100)

甲硝唑 (Metronidazole，MTZ)具有廣譜抗厭氧菌和抗原蟲的作用，臨床主要用于預(yù)防和治療厭氧菌引起的感染，是硝基咪唑類的代表性藥物[1-2]。其抗厭氧菌的作用機理為，在厭氧細胞內(nèi)甲硝唑被還原為中間活性物，該中間物與細菌內(nèi)的DNA作用，使DNA螺旋結(jié)構(gòu)斷裂，破壞微生物正常的新陳代謝而致細胞死亡[3-4]。近年來報道甲硝唑在臨床上存在著耐藥性和不良反應(yīng)，對甲硝唑進行修飾，增強其抗菌作用，減少不良反應(yīng)，是藥物化學(xué)領(lǐng)域一個熱門課題。

許多金屬離子與藥物結(jié)合，能增強藥物的抗菌能力，有報道甲硝唑金屬配合物通過甲硝唑與金屬離子的協(xié)同作用表現(xiàn)較強的抗菌活性[5]。而金屬錳在生物學(xué)中作為酶的激活劑和必需輔助因子具有許多重要作用，尤其對骨骼發(fā)育、細胞結(jié)構(gòu)、能量代謝、線粒體氧化還原和細胞凋亡至關(guān)重要[6]。多項體外研究表明Mn 與DNA、RNA 和核糖體結(jié)合導(dǎo)致蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯失調(diào)[7]。近年來，Mn(II) 作為一種能夠有效調(diào)節(jié)細胞代謝的新型金屬元素引起了廣泛關(guān)注[8]。

Scheme 1

研究表明甲硝唑的一些過渡金屬配合物較甲硝唑具有良好的體外抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的性能[9]，而關(guān)于甲硝唑錳配合物和DNA相互作用的研究未見報道。以甲硝唑與醋酸錳(Ⅱ)為原料，合成甲硝唑的錳 (Ⅱ)配合物，并通過元素分析、IR、UV-Vis、電導(dǎo)率、熱失重等方法對其進行了結(jié)構(gòu)表征，研究了配合物與小牛胸腺DNA(ct-DNA)的相互作用方式，希望為進一步探討甲硝唑金屬藥物的抗菌機理提供參考信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Vario EL-IIIG型元素分析儀；EQUINOX55 型紅外光譜儀；800型紫外可見分光光度計；Ubbeoldhe型粘度計；DDS-307型電導(dǎo)率儀。

甲硝唑 (原料藥,陜西省藥檢所)，小牛胸腺DNA(生化試劑，Sigma公司)；其余所用試劑均為分析純。

1.2 配合物的合成

分別稱取甲硝唑0.342g(2 mmol)溶解于15 mL甲醇中，醋酸錳[Mn(AcO)2·4H2O)] 0.245g(1 mmol)溶解于10 mL甲醇中，將甲硝唑溶液緩慢加入到醋酸錳溶液中，在室溫下攪拌反應(yīng)72 h，過濾靜置，室溫下?lián)]發(fā)溶劑。20 d后有紅棕色黏稠物生成，加入無水乙醚形成土色沉淀，過濾，濾餅用無水乙醚洗滌、干燥得淡棕色粉末狀固體，產(chǎn)率75%(以Mn計)。

1.3 配體及其配合物與DNA相互作用

與DNA相互作用實驗所需試劑的配制及相關(guān)實驗操作按照文獻[10-11]方法進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的結(jié)構(gòu)表征

(1) 元素分析和摩爾電導(dǎo)率

表1的數(shù)據(jù)表明配合物元素分析的實驗值與理論值較為一致，基本可以確定其化學(xué)組成。根據(jù)摩爾電導(dǎo)率值可以判斷配合物在甲醇中屬于非電解質(zhì)[12]。

表1 配合物的元素分析及摩爾電導(dǎo)率Table 1 Element analysis and molar conductivity data of complex

(2) IR

當甲硝唑配體形成金屬配合物以后,有些特征吸收峰發(fā)生了一定程度的偏移，其中咪唑環(huán)上的ν(C=N)伸縮振動由1536 cm-1向高波數(shù)1541 cm-1發(fā)生了偏移,說明金屬與咪唑環(huán)上的3-N發(fā)生了配位[13]，而位于指紋區(qū)的445 cm-1吸收峰可以指派為配位鍵ν(Mn—N)。硝基的伸縮振動ν(NO2)吸收峰變化不大，說明硝基未參與配位[14]。與配體相比，配合物中含有CH3COO-，其νas(COO-) 和νs(COO-)分別為1566 cm-1，1360 cm-1，Δνas(COO-)-νs(COO-)值為206 cm-1，這與文獻報道[15]的醋酸根對稱橋連配位模式的紅外吸收峰情況基本一致，說明醋酸根可能與兩個Mn原子橋連配位[16]。同時配合物在3400 cm-1處有一寬峰，表明有水參與配位[17]。

(3) UV-Vis

由圖1可見，配體在200～400 nm范圍內(nèi)有兩個主要吸收峰分別位于240 nm和320 nm處，可分別歸屬為有機配體咪唑環(huán)共軛體系的π→π*和n→π*電子躍遷。和配體相比，配合物在240 nm處的吸收發(fā)生了紫移，出現(xiàn)在230 nm處，并且紫外吸收強度明顯增強，這是金屬Mn(Ⅱ)離子與配體發(fā)生配位的結(jié)果。

λ/nm圖1 配體L和配合物的UV-Vis譜圖Figure 1 The UV-Vis spectru of Ligand and complex

(4) TGA

由圖2可見配合物[Mn2(C6H9O3N3)2(Ac)4(H2O)2]·6H2O熱分解過程大致有4步。首先在68～188 ℃表現(xiàn)兩個吸熱過程，TG曲線坍塌失重12.89%，該失重的兩個吸熱過程是配合物逐步失去6個結(jié)晶水分子(失重理論值為12.98%)所致。第二步的熱分解溫度區(qū)間為189～240 ℃，DSC表現(xiàn)出有一個放熱峰和一個吸熱峰，TG曲線顯示失重18.87%，該過程是配合物受熱失去兩個配位水分子和兩個醋酸根離子所致(失重理論值為18.52%)。第三步的熱分解溫度區(qū)間為190～325 ℃，DSC曲線顯示吸熱過程的峰頂溫度為305 ℃，失重率為20.20%，對應(yīng)于失去一個甲硝唑分子(失重理論值為20.56%)。第四步配合物失去最后一個甲硝唑配體分子(失重率理論值20.56%)，熱分解溫度區(qū)間位于326～830 ℃，在813 ℃有一弱的放熱過程，失重率21.52%，隨著連續(xù)加熱配合物不斷失重，當加熱至1000 ℃時殘余物為黑色，含量20.66%，與生成MnO2的理論殘余量20.91%相近。

Temperature/℃圖 2 配合物的TGA曲線圖Figure 2 TGA curves of complex

2.2 配合物結(jié)構(gòu)

根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻[16]，配合物[Mn2(C6H9O3N3)2(Ac)4(H2O)2]·6H2O的結(jié)構(gòu)如Chart 1所示。

Chart 1

2.3 配合物與ct-DNA的相互作用

(1) 甲硝唑及其配合物與DNA相互作用的UV-Vis

由圖3可見，在320 nm左右甲硝唑配體及配合物均有紫外最大特征吸收峰，為甲硝唑分子內(nèi)π→π*的電子躍遷吸收。配體及配合物的紫外特征吸收峰隨著DNA的不斷加入都表現(xiàn)出顯著的減色效應(yīng)(0.95→0.91，2.15→2.07)，表明配合物與DNA發(fā)生了鍵合作用[18-19]。

(2) 甲硝唑及其配合物與 ct-DNA 相互作用的熒光光譜

圖4表明甲硝唑配體及其配合物的熒光強度隨著DNA濃度的增大均表現(xiàn)出顯著的增色效應(yīng)，甲硝唑的熒光強度增幅大于配合物。化合物熒光強度增加，究其原因可能是甲硝唑及其配合物插入或部分插入DNA分子所致。因為當化合物插入剛性比較強的DNA分子時，DNA能夠很好地保護化合物發(fā)光，這與己知的一些插入試劑在DNA存在時熒光強度增強的現(xiàn)象一致[20-22]。

λ/nm

(3) 甲硝唑及其配合物與 ct-DNA 相互作用的黏度

具有光學(xué)活性的光物理探針對于探討鍵合模式一般可以提供必要的但不是充分的證據(jù)[23]。沒有晶體數(shù)據(jù)時，一般認為確定鍵合模式最有力的證據(jù)之一是物質(zhì)黏度的變化，分子長度的變化對物質(zhì)黏度的影響非常大[24]。若化合物以經(jīng)典插入方式與DNA相互作用，DNA相鄰堿基對的距離會變大，DNA螺旋拉長，導(dǎo)致DNA黏度增加。若DNA溶液的黏度幾乎不變，則化合物與DNA相互作用是以非插入方式(靜電、溝槽結(jié)合等)進行的。DNA的黏度如果減小，則化合物以部分插入方式與DNA作用，這時DNA的雙螺旋可能發(fā)生扭結(jié)或彎曲導(dǎo)致黏度減小[25-27]。因而，需用黏度法對光譜法得到的結(jié)果進行驗證，以便較為準確的判斷化合物與DNA的鍵合模式。

λ/nm

由圖5可以看出，DNA溶液的黏度隨各物質(zhì)濃度的增加而增大，配體L對DNA溶液黏度的影響更大。黏度分析的結(jié)果表明配體及配合物均以插入方式與DNA相互作用，由于甲硝唑配體分子的平面性強于配合物，配體與DNA的相互作用力較大，這與光譜實驗的結(jié)果一致。

Ccompound/CNDA圖 5 配體L及其配合物濃度對DNA粘度的影響Figure 5 Effects of increasing amount of L and complex on the viscosity of DNA

合成了甲硝唑的Mn(Ⅱ) 配合物[Mn2(C6H9O3N3)2(Ac)4(H2O)2]·6H2O，利用元素分析、紫外光譜、紅外光譜、摩爾電導(dǎo)率、熱重分析等分析方法確定了產(chǎn)物可能是一個醋酸根橋連的二核金屬配合物。并通過紫外吸收光譜、熒光光譜及黏度法研究了甲硝唑配體及其錳配合物與 ct-DNA的相互作用，綜合分析光譜法和黏度法的實驗結(jié)果可以認為配體及其錳配合物與 ct-DNA之間可能以經(jīng)典的插入式相互作用，由于甲硝唑配體分子結(jié)構(gòu)的平面性較配合物更好，配體與ct-DNA的相互作用強于配合物。