潛在益生乳酸菌分離和鑒定研究進展

湯回花，李 宏，陶慧玲，劉畢琴，王馨蕊，王瀚墨，史 巧*

（1.云南省農業科學院 農產品加工研究所，云南 昆明 650223；2.云南省農業科學院國際農業研究所，云南 昆明 650223）

乳酸菌是一類重要的益生菌，常占據并定殖于宿主腸道，調控并保持著宿主和體內微生物群之間的動態平衡。研究發現，乳酸菌具有促進營養成分吸收、提高人體免疫力、維持腸道菌群平衡等多種益生功能[1-3]。2014年，由國際益生菌與益生元科學聯合會發布了關于益生菌的共識，其中突出強調益生菌的三個核心特征：①足夠數量；②活菌狀態；③有益健康功能[4]。聯合國糧食及農業組織（food and agriculture organization of the united nations，FAO）與世界衛生組織（world health organization，WHO）推薦僅從人的胃腸道分離的乳酸菌可在食品中使用，并且應進行體外測試和體內實驗來證實其益生功能。主要包括安全性，儲存過程中的活性，對胃酸的抵抗力，對膽汁的耐受性，對腸上皮細胞的粘附性，抗菌物質的產生，刺激免疫反應以及影響代謝活動的能力[5]。益生乳酸菌的初步篩選還包括基因型和表型穩定性，質粒穩定性，碳水化合物利用模式，抗生素耐藥性，對病原菌抑制作用以及免疫原性等測試[6]。此外，益生菌應易于大規模培養，并且能夠抵抗制備過程中的技術操作，例如加熱和低氧條件。

隨著人們意識到健康飲食在促進人體健康和預防疾病方面具有重要作用，益生乳酸菌在普通食品、膳食營養補充劑和嬰幼兒配方食品等領域均得到了廣泛應用。來自ZION Market Research的數據顯示，我國益生乳酸菌產業連續3年增長率在20%以上，預計2025年全球益生乳酸菌產業的產值將超過770億美元，中國市場占比將超過25%。擴大益生乳酸菌的篩選范圍和菌株高速準確鑒定有望在未來幾年推動該行業的增長。故本文從潛在益生乳酸菌的分離及鑒定技術進行綜述，以期為我國益生乳酸菌自主開發利用提供借鑒。

1 潛在益生乳酸菌分離來源

益生菌市場需求的大幅增加推動著國內外研究學者對優良益生乳酸菌菌株的篩選研究。目前我國商用食品益生乳酸菌來源于健康人體的胃腸道，但由于腸道內微環境為厭氧環境，與外界環境差異較大，并且人體腸道內菌群組成十分復雜，使用最佳的厭氧培養方法也很難對胃腸道內的乳酸菌進行有效分離。因此，尋找食品來源的益生乳酸菌已成為食品微生物學研究的熱點。與來自腸道的益生菌相比，食品來源的益生乳酸菌更適應食品環境，易形成更好的感官品質。HAN Q等[7]對從哈爾濱干香腸中分離得到的4株菌（戊糖片球菌R1、短乳桿菌R4、彎曲乳桿菌R5和發酵乳桿菌R6）和發酵乳制品分離益生乳酸菌進行體外比較，發現這4株菌對人的胃腸道有良好的耐受性，并具有體外抗氧化作用，可用于食品加工中的備選益生乳酸菌資源。

1.1 母乳來源

母乳是嬰兒營養的黃金標準，富含免疫因子、脂類、寡糖和激素等多種生物活性成分[8-9]。從母乳中分離出的益生乳酸菌主要有羅伊氏乳桿菌、格氏乳桿菌和屎腸球菌。RAJOKA M R等[10]從母乳中分離出乳桿菌并對其進行體外實驗，發現其具有耐酸、耐膽鹽、抗氧化性能以及抗生素耐藥性。同時，他們發現被測試的乳桿菌對宮頸癌細胞有很好的抑制作用。REBECA A等[11]從母乳中分離出發酵乳桿菌CECT 5716、唾液乳桿菌CECT 5713可用于治療乳腺炎，還發現乳腺炎患者經過相關益生乳酸菌治療后，其乳汁中細菌數量顯著減少且健康狀況得到明顯改善，并且發酵乳桿菌CECT 5716在2016年被國家衛計委列入《可用于嬰幼兒食品的菌種名單》。另外，研究發現在治療胃腸道炎癥時，直接攝入乳酸菌比抗生素效果更好，而且危險性和副作用幾乎為零[12-13]。如今抗生素濫用現象普遍，使用國際公認最安全的益生菌來代替需要肝腎臟代謝的抗生素的研究變得十分重要，源于健康母乳的益生微生物可提高免疫和腸道健康，如能從母乳中分離篩選到有益微生物，利用其生產的健康食品具有非常廣闊的商業前景。

1.2 動物乳及乳制品來源

自然發酵乳制品的制作和食用歷經數千年的傳承，加之不同的氣候環境、地理因素以及不同的制作工藝，使得其中蘊藏的乳酸菌生物多樣性極為豐富。這些乳酸菌經過長期的自然選擇和馴化，不乏具有優良益生特性和生產特性的菌株，主要包括乳桿菌、乳球菌或鏈球菌屬的細菌。從奶源中分離出的新的本土益生乳酸菌菌株因其許多健康益處而聞名，如駱駝奶或馬奶，可以與商業菌株競爭[16]。RZEPKOWSKA A等[14]從有機乳清原料中分離出16株乳桿菌菌株，其中7株被鑒定為植物乳桿菌，其余為發酵乳桿菌。所有菌株均能利用碳水化合物并具有β-半乳糖苷酶活性，部分菌株還可以降低硝酸鹽含量。許女等[15]從藏靈菇乳中篩選出一株植物乳桿菌Z4對羥自由基（·OH）和1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基有較好的清除效果，清除率分別達到75.2%和53.7%。

1.3 植物及其發酵制品

益生乳酸菌也可以從植物及其發酵產品中分離得到。XING Z等[17]從西藏青草籽粒中分離出具有較高胞外多糖產量的乳桿菌XL10，已被證明在體外和體內具有益生菌潛力。OLIVEIRA J S等[18]從發酵可可漿中分離出發酵乳桿菌TcUESC01和植物乳桿菌TcUESC02，通過檢測小鼠口服沙門氏菌后的存活率，發現這兩株乳桿菌對腸病原菌具有拮抗作用。AAB A等[19]從柑橘類水果分離出兩株戊糖乳桿菌可以在低pH（3），膽汁鹽（4%），NaCl（6%）和苯酚（0.6%）存在的條件下存活，能產生有益于人體健康的膽鹽水解酶和β-半乳糖苷酶。劉之園等[20]從水果酵素中分離出產淀粉酶、DPPH自由基清除（91.46%）及產酸（13.14 g/L）能力強的副干酪乳桿菌B6，可作為優良菌株進行研究與開發。此外，發酵蔬菜食品中也含有豐富的乳酸菌，如傳統的發酵卷心菜和黃瓜。ZIELIN′SKA D等[21]從腌漬樣品中分離出38株乳酸菌，其中14株被鑒定為乳桿菌屬。經篩選有10株被認為是安全的，具有益生菌功能特性，可作為益生菌備選菌株。

2 益生乳酸菌鑒定

作為供人類食用的益生菌產品，為了使益生菌功效和安全性得到保證，在開發使用過程中的鑒定技術至關重要。早期采用分子生物學方法對乳酸菌進行屬、種水平鑒定，如16S～23S rRNA測序，變性梯度凝膠電泳，脈沖場凝膠電泳，擴增核糖體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）限制性分析（amplified ribosomal deoxyribonucleic acid restriction analysis，ARDRA），DNA-DNA 雜 交（DNA-DNA hybridization，DDH），在很大程度上有助于分類鑒定乳酸菌[22]。20世紀60年代以來，使用DDH被稱為分類學中的“金標準”，但是DDH存在著對親緣關系較遠的物種靈敏度不夠以及工作量大、耗時長等缺點。此外，16S rRNA因其基因保守、穩定且不受水平基因轉移的影響，成為細菌分類鑒定的重要依據從而得到了廣泛應用，但是這種方法在區分兩個相似性很高的近緣菌種或亞種時會引起偏差。HUYS G等[23]研究表明，超過28%的市售益生菌產品在菌株水平上被錯誤地標記，所以在菌株水平上正確識別對益生菌安全評估至關重要。隨著新型微生物鑒定方法迅速發展和普及，基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF MS）、全基因組測序、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,RT-FQ-PCR）等技術能夠在菌株水平上鑒定益生菌，下文主要介紹應用潛力較大的四種益生乳酸菌鑒定方法。

2.1 MALDI-TOF MS 快速鑒定和分類

MALDI-TOF MS是一種基于表型的方法，根據微生物特定蛋白質組學特征對其進行鑒定[24-25]。當該方法與特定的質譜峰結合時，可以實現亞種和菌株水平上的分類鑒定[26]，常應用于常規臨床診斷，現在已擴展到食品安全、生物多樣性和腸道微生物學[27-28]，如采用MALDI-TOF MS鑒定乳制品和肉制品中的乳酸菌[29-30]。HUANGCH等[31]使用MALDITOF MS通過乙醇/甲酸/乙腈進行蛋白質提取來快速鑒定干酪乳桿菌群菌株，結果顯示MALDI-TOF MS鑒定與脫氧核糖核酸（DNA）測序、聚合酶鏈式反應（PCR）方法相比，具有更高的區分能力和更短的分析時間，可有效控制益生菌產品質量，但由于購買和運行MALDI-TOF MS的成本非常高，通常只用于實驗室鑒定或結合其他方法如16S rRNA測序來區分種類相近的菌屬。另外，該方法樣品制備不易，需要新鮮、純凈的培養物和足夠的細菌量（105～107個細胞）進行蛋白提取和分析。

2.2 SNPs-微量測序分析

單核苷酸多態性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）是繼限制性片段多態性和短串聯重復序列外的第三代遺傳標記，具有遺傳穩定、數量多、檢測片段短、可以高通量、自動化檢測等特點。SNPs即微測序，是以熒光染料標記的雙脫氧核苷酸（dideoxynucleotide，ddNTP）進行等位基因特異性引物延伸來檢測SNP。每種熒光標記的ddNTP有唯一發射波長，然后將其轉換為每個堿基的特定顏色。帶有熒光標記的延伸產物可以通過毛細管電泳和自動測序技術進行可視化。HUANG C H等[32]通過使用dnaK基因序列設計了干酪乳桿菌組群的PCR引物對，進行SNPs-微量測序分析以鑒定屬于干酪乳桿菌組群的物種，并與16S rRNA測序進行對比，發現利用dnaK基因可以清晰地區分干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、玉米乳桿菌和鼠李糖乳桿菌。dnaK基因的平均序列相似性（87.8%）顯著低于16SrRNA序列（99.1%）。因此，dnaK基因可以作為干酪乳桿菌的另一種分子系統發育標記，其分辨率高于16S rRNA。隨后HUANG C H等[33]利用物種特異性PCR技術結合SNPs-微量測序分析實現鼠李糖乳桿菌與干酪乳桿菌鼠李糖亞種鑒定，以dnaJ基因為靶點，建立物種特異性PCR引物。結果表明，該引物對鼠李糖乳桿菌具有特異性，并能明確地將鼠李糖乳桿菌與干酪乳桿菌鼠李糖亞種區分，成功建立了一種快速、準確、經濟的鼠李糖乳桿菌物種鑒別方法，可用于益生菌產品的質量控制。另外SNPs-微量測序分析可精確定位特定核苷酸位點，尤其是在單個反應管中同時篩選多個SNP時，短序列僅需40 min即可進行自動熒光毛細管電泳，因此這種方法比直接測序效率更高。

2.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應

RT-FQ-PCR是在傳統的PCR技術上發展而來的，是指在PCR體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線或內參基因對未知模板進行定量分析的方法。它不僅能判斷某一基因的有無，還可以對其進行定性定量分析，從而用于佐證區分不同物種，并量化樣品中的細菌濃度。常見的熒光化學物質有SYBRGreen熒光染料、TaqMan熒光探針和分子信標。SYBRGreen可以非特異性的與DNA雙鏈結合，通過溶解曲線，確定PCR是否特異，并通過TaqMan熒光探針的引入實現熒光信號的累積與PCR產物形成進而對模板定量分析。如果已知菌株特異性序列，則可以直接通過RT-FQ-PCR技術對菌株進行檢測和定量分析。MOSER A等[34]根據瑞士乳桿菌的苯丙氨酰-轉移核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）合成酶α亞基基因（pheS）序列設計特異性引物進行RT-FQ-PCR分析，建立了一種能夠快速準確檢測瑞士乳桿菌方法。孫暢等[35]通過對比RT-FQ-PCR與國標法，發現RT-FQ-PCR可快速、準確檢測出發酵豆乳中植物乳桿菌和副干酪乳桿菌及其含量。陳嘉康[36]利用RT-FQ-PCR技術與疊氮溴化丙錠結合，可快速對泡菜中的目標菌株植物乳桿菌NCU116進行定性和活菌計數。RT-FQ-PCR是一種高度靈敏，特異和準確的方法，可同時檢測和定量微生物群落中的細菌。與培養法相比，RT-FQ-PCR速度更快，設備較便宜，適合日常例行分析，加之不需要富集培養，還可以降低污染的風險，是一種對菌株進行特異性鑒定的理想方法[37]。

2.4 全基因組測序

全基因組測序技術經歷了一到三代DNA 測序技術的演變。第一代雙脫氧鏈終止法（Sanger）由于操作簡便，應用最為廣泛，以Sanger法為基礎開發出多種測序技術。進入后基因組時代后，為滿足對基因組進行大規模測序的需求，二代高通量測序技術被研究者所開發，主要原理為邊合成邊測序，主要包括Ion Torrent測序技術、羅氏454測序技術和Illumina測序技術。但在測序過程中，二代技術錯誤率較高。至今，測序技術已發展至第三代，大大縮短了運行時間，加大了讀取長度[38]。目前，以二代和三代測序技術結合的方式完成全基因組測序是一種準確有效研究乳酸菌的方法[39]。HUANG C H等[40]分析兩個新菌株（BCRC 81062T和BCRC 18859）的全基因組序列，采用直系同源基因的全基因組平均核苷酸一致性（orthologous average nucleotide identity，OrthoANI）估算平均核苷酸一致性（averagenucleotide identity，ANI），并使用基因組距離計算器（GGDC 2.0）進行數字DNA-DNA雜交，發現新菌株與密切相關菌株物種間相似度范圍為7%～44%，因此證實了這兩個菌株代表了一個新物種，其名稱為Lactobacillus chiayiensissp。LI B等[41]從中國傳統發酵乳制品中分離出瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）KLDS1.8701，通過全基因組序列分析鑒定出含有許多益生菌相關基因，同時體外實驗和體內實驗發現該菌株高度穩定，安全并且適合用于食品工業。

在已知某菌株全基因組序列的基礎上，還可以開發該菌株的特異性PCR引物，進行PCR鑒定分析[42]；也可以直接從待測品中提取DNA生成全基因組數據來與已知菌株全基因組比對，證明是否為同一菌株；同時全基因組數據也可以用來衡量產品純度，如某種加工產品被一種微生物污染了，那它的全基因組數據將會包含污染菌株的基因組序列數據，將該產品的全基因組數據與參考基因組數據庫（如美國國立生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的DNA序列數據庫）進行交叉比對來識別污染菌株。另外，還可以利用多菌株混合產品的全基因組數據來測量某種菌株的相對豐度。目前，利用全基因組測序來衡量細菌生存能力的領域正在快速發展，該技術基于細胞膜受損后細胞“死亡”這一假設，在待測菌株中加入一種化學物質，該物質不能滲透完整的（活細胞）細胞膜，只能滲透細胞膜受損（死細胞）的細胞。一旦進入這些“死亡”細胞，這些化學物質就會與DNA發生反應，使其無法進行測序[43]。這些方法的不斷發展，有助于運用全基因組測序評估益生菌產品的穩定性和活力。

3 結語

在過去的幾十年中，益生菌在休閑食品、保健食品和嬰幼兒配方等食品中得到了廣泛應用。隨著消費者越來越意識到益生菌在促進人體健康和預防疾病中的重要性，近幾十年來對益生菌補充劑的需求不斷增長。因此，從適合的來源中分離并快速可靠地鑒定潛在益生乳酸菌菌株，進而篩選安全、高活性益生菌是未來研究趨勢。為了確保產品質量安全，需要快速可靠的工具來鑒定和定量產品中的益生菌菌株。現在已經建立了微生物學方法和分子生物學等方法來鑒定益生菌。這些方法通常具有足夠的特異性，可以鑒定種屬水平的益生菌菌株，如MALDI-TOF MS 越來越多地用于鑒定細菌種類，但購買和運行MALDITOF MS的成本非常高，MALDI-TOF MS在微生物學中的未來應用將取決于數據庫的擴展，例如獸醫醫學、植物病理學、食品安全、工業微生物學和藥理學等領域。為了在這些研究領域中可靠地鑒定微生物，必須對相關參考物種和菌株進行分析，并將其納入數據庫中。分子生物學方法已成為鑒定、篩選和分析益生菌的有效工具，RT-FQ-PCR技術除鑒定外，還可用于細菌的定量分析，其快速、經濟且樣品易于處理，是細菌定量定性分析最常用方法之一。其次，目前全基因組測序應用廣泛，能更快地篩選出具有生理特性和功能特性的菌株。根據乳酸菌適宜環境篩選特定用途的菌種，并運用現代技術將其有效鑒定將為新型益生菌開發及其在食品中的應用技術提供保障。