外泌體在肺移植中的研究進展

趙小瓊,肖漓

1.佳木斯大學，佳木斯 154007；2.中國人民解放軍總醫院第八醫學中心呼吸與危重癥醫學部研究所 北京市器官移植與免疫調節重點實驗室

1 外泌體

細胞外囊泡(EVs)是由細胞分泌的各種具有雙層膜結構的囊泡的統稱。細胞外囊泡可分為4個亞群：外泌體、微粒(微囊泡)、凋亡小體和癌小體，而目前研究點主要集中在外泌體[1]。外泌體是由細胞內溶酶體反向出芽形成的杯狀囊泡，40～100 nm，通過與質膜融合從細胞中釋放出來[2]。1983年，外泌體首次于綿羊網織紅細胞中被發現，1987年Johnstone將其命名為“exosome”。大多數細胞都可以分泌外泌體，例如肥大細胞、樹突狀細胞、T和B淋巴細胞、間充質干細胞、脂肪細胞、內皮細胞和上皮細胞等等[3]。并且在多種體液，如血液、尿液、腹水、母乳、唾液、羊水、淋巴液和支氣管肺泡灌洗液(BALF)等中都發現了外泌體[4]。外泌體含有多種生物分子，包括糖類、蛋白質、脂類、核酸(即DNA和RNA)和代謝物等[5]。根據目前的外泌體內容數據庫Exocarta，各種生物和細胞類型的外泌體含有41 860種蛋白質、3 408種mRNA、2 838種microRNA(miRNA)和1 116種脂質。

外泌體的組成取決于其來源的細胞，如器官移植、超敏反應、癌癥、感染性疾病和其他病理條件下，循環外泌體的表面標志物和內含物都不相同。肺移植受者(LTxRs)中的循環外泌體存在組織相關自身抗原(SAgs)——K-α1微管蛋白(Ka1T)和膠原蛋白V(Col-V)、共刺激分子、轉錄因子核因子κB(NF-κB)、缺氧誘導因子(HIF)、20S蛋白酶體、MHC Ⅱ類分子和其轉錄因子CIITA等[6]。通過研究外泌體的生物成分，對理解其在移植排斥反應中的作用至關重要。有研究[6]表明，小鼠對腎SAg 基底膜聚糖的體液免疫反應是由外泌體中存在的20S蛋白酶體引起的，20S蛋白酶體失活后，小鼠對腎的自身免疫性反應也將消失。外泌體中含有豐富的生物成分，可作為生物標志物監測移植排斥反應、疾病進展和預后狀況等，將會有光明的應用前景；同時外泌體作為抗原提呈囊泡(APVs)，參與肺移植(LTx)后的固有免疫和適應性免疫應答；外泌體具有遞送生物分子的功能，還有發展成為臨床藥物遞送載體的潛力。2013年諾貝爾生理學或醫學獎被授予了發現囊泡運輸調控機制的研究人員，強調了外泌體對生物學領域的影響。

2 外泌體是重要的生物標志物

對于許多被診斷為終末期肺疾病的患者來說，LTx是唯一的治療措施[7]。根據國際心肺移植協會的登記報告顯示，截至2017年6月30日，全球已有67 260例LTx手術。隨著醫療技術和免疫抑制的不斷發展，LTx越來越成熟，但術后仍會出現很多并發癥，像感染、急性排斥反應(AR)、慢性排斥反應(CR)、急性肺水腫和心血管疾病等等。其中CR在LTx術后最為常見，5年內發生率約為50%，10年內發生率可達90%[4]。CR中慢性同種異體肺移植功能障礙(CLAD)導致的肺衰竭是移植后一年內死亡的主要原因[8]。CLAD包括閉塞性細支氣管炎綜合征(BOS)和限制性同種異體肺移植綜合征2種亞型[4，9]。BOS是CLAD最常見的臨床表現，大約70%的CLAD患者會發生BOS[9]。

LTx術后，臨床醫生通過支氣管鏡活檢、影像學檢查等方法監測排斥反應。然而，這些方法缺乏準確性、特異性，常常反映移植肺損傷的非早期。因此，在LTx領域迫切需要開發新的診斷生物標志物，對同種異體LTx進行無創和連續監測。發生排斥反應與否的LTxRs外泌體的主要成分不同，其有望成為同種異體移植排斥反應的預測/診斷生物標志物。

2.1 外泌體——肺相關自身抗原 發生排斥反應的主要原因是異體移植物與受者人類白細胞抗原(HLA)不匹配，被受者的免疫監測所識別。Sureshbabu等[9]報道診斷為AR和CR的LTxRs血清和BALF中存在外泌體，這些外泌體攜帶有特異性抗原，參與了同種異體LTx的排斥反應。原發性移植物功能障礙(PGD)、缺血再灌注損傷、呼吸道病毒感染(RVI)、供者特異性抗體(DSA)和肺相關SAgs (Ka1T和Col-V)抗體的產生等會誘導循環外泌體的釋放[4]。CLAD患者的循環外泌體表達：與受者錯配的HLA分子、肺相關SAgs、共刺激分子(CD80,CD86)、轉錄因子NF-κβ、HIF-1α、microRNA(miRNA)和20S蛋白酶體等[6]。Gunasekaran等[10]研究發現非排斥患者的外泌體不表達MHC Ⅱ類分子和共刺激分子(CD80、CD86、CD40)，但黏附分子在LTxRs的循環外泌體上都有表達。

HLA分子和(或)肺相關SAgs抗體的產生是預測排斥反應的標志。在發生排斥反應的LTxRs中，在供者來源的外泌體表面檢測到供者HLA和SAgs，在穩定性LTxRs的供者來源的外泌體上沒有檢測到SAgs，表明循環外泌體來源于免疫損傷后的移植器官[9，11]。供者來源的外泌體從移植物中“滲漏”出來，并通過受者毛細淋巴管外滲或切斷的開口向移植物引流的淋巴器官流動。Habertheuer等[7]將Wistar轉基因鼠的左肺移植到MHC分子完全不匹配的Lewis受者中,GFP標記CD63檢測外泌體水平，循環外泌體在第1天達到峰值，第2天顯著下降，然后在第3天達到基線水平，符合AR的表現。外泌體水平快速下降，發生在移植出現AR的組織學證據之前，提示外泌體可以作為一種新的生物標志物。

Rahman等[12]在原位單側LTx CR的小鼠模型中，觀察到超過80%的移植小鼠從第14天開始，血清中分離的外泌體顯示肺SAgs(Col-V和Ka1T)水平升高，血清中還存在抗肺SAgs的抗體，而在第30天才出現CR的組織學變化，表明外泌體可能是CR的潛在生物標志物，并推測外泌體可能參與了LTx后CR的發生。Sharma等[13]研究表明，在BOS臨床診斷前12個月，從血漿中分離的外泌體顯示肺SAgs(Ka1T和Col-V)水平的升高(特異性為100%，敏感性為90%)，表明帶有肺SAgs的循環外泌體可作為鑒別有BOS風險的LTxRs生物標志物。Mohanakumar等[14]用BOS患者的循環外泌體(添加佐劑)免疫小鼠，供者氣道上皮細胞(AEC)分泌的外泌體具有高度免疫原性，含有HLA Ⅱ類分子、20S蛋白酶體和共刺激分子等，小鼠脾臟T細胞對外泌體上兩種SAgs(Ka1T和Col-V)均有反應，γ-干擾素(IFN-γ)和白細胞介素17(IL-17)生成增加，白細胞介素10(IL-10)水平降低。因此，AEC分泌的外泌體會增強LTx后的免疫反應，導致排斥反應的發生。

棒狀細胞分泌蛋白(CCSP)具有抗炎功能，在吸煙、感染、肺損傷、BOS和其他可導致炎癥反應的疾病中，CCSP水平下降。據Itabashi等[15]報道，在BOS臨床診斷前7～9個月，患者BALF中CCSP水平顯著下降，低水平的CCSP可以促進促炎細胞因子的產生、自然殺傷細胞(NK細胞)來源外泌體的誘導以及對HLA和SAgs的免疫反應，NK細胞來源的外泌體含有增加的SAgs、NK細胞標志物和細胞毒性分子，提示NK細胞來源的外泌體在CLAD發生中發揮作用。CCSP缺失導致NK細胞釋放外泌體，能夠刺激移植后固有免疫和適應性免疫應答，增加了BOS的風險。

Goodlet等[16]報告，1例76歲的女性肺移植患者，因AR接受免疫抑制劑治療后，隨后感染了SARS-CoV-2，HLA抗體水平開始急劇增加。在SARS-CoV-2感染前，對循環外泌體分析顯示存在肺SAgs、HLA-DR和HLA-DQ?；颊吒腥維ARS-CoV-2后，發現外泌體含有SARS-CoV-2刺突蛋白，感染癥狀消除后，不再檢測到含有SARS-CoV-2刺突蛋白的外泌體，然而，具有肺SAgs、HLA-DR和HLA-DQ的外泌體始終存在，肺功能持續下降，提示患者出現CLAD。以上表明，檢測含有病毒蛋白的外泌體可能有助于識別由病毒感染引起的同種異體移植物損傷。

抗HLA和抗肺相關SAgs可能在BOS的免疫發病機制中發揮協同作用，并且是BOS進展的重要預測因子[17]。大多數產生DSA的患者隨后也會產生肺相關SAgs抗體，表明DSA可能會激活并誘導肺相關SAgs抗體的產生[18]。Sureshbabu等[9]對103例LTxRs的分析表明，42.7%的LTxRs產生了DSA,30.1%的LTxRs產生了Kα1T和ColV抗體，表明DSA的產生通常先于肺SAgs抗體的產生。此外，HLA抗原和肺相關SAgs，彼此相互影響產生抗體的概率更大，提示存在免疫擴散現象。研究表明肺相關SAg(Kα1T)不僅可以誘導小鼠產生對Kα1T的抗體，還可以誘導小鼠產生對Col-V的抗體，表明在小鼠LTx CR模型中，在BOS形成之前出現了免疫應答擴散。然而，由于HLA分子和肺相關SAgs在不同的染色體上由不同基因編碼，所以導致其擴散的機制尚不清楚[6]。

2.2 外泌體-miRNAs miRNA可作為新的診斷生物標志物來識別有BOS發展風險的患者。miRNA是器官移植領域的研究熱點，它們與靶mRNA結合調控基因表達，這些基因是先天和適應性免疫應答的關鍵要素。DSA可以誘導生成miRNA，已知的外泌體包含的miRNA，可誘導炎癥、內皮激活、Th17分化和抗體介導的排斥反應等，從而觸發免疫應答。Xu等[19]研究表明，與穩定性LTxRs血清樣本相比，在BOS 12個月時，miR-134、miR-10a、miR-195和miR-133b的表達水平顯著下調，miR-144、miR-142-5p和miR-155表達顯著上調。還有TGF-β相關miRNA，即miR-369-5p和miR-144，它們在TGF-β信號通路介導的纖維化中發揮作用。根據上述miRNA可以區分有BOS發展風險的LTxRs。

帶有肺相關SAgs的循環外泌體可以預測LTxRs發生CLAD的風險，提示臨床醫生在LTx發生不可逆損害之前提前制訂預防或干預策略。在人類腎臟和心臟移植后CR發生之前，也檢測到帶有組織相關SAgs的循環外泌體[13]。Vallabhajosyula等[20]對人類胰島和腎移植受者進行5年隨訪，分析循環外泌體，發現帶有組織特異性SAgs的外泌體長期存在。因此認為，具有組織特異性SAgs的循環外泌體有望成為一種無創性生物標志物，可以監測實體器官移植受者發生排斥反應的風險，為臨床移植提供巨大幫助。

3 外泌體在LTx排斥反應中的作用

Sureshbabu等[9]在小鼠支氣管內給予MHC抗體，誘導呼吸道阻塞疾病(OAD)，類似于人類CLAD，重要的是，在OAD臨床診斷前檢測到了對于外泌體上肺相關SAgs(Col-V,Kα1T)的抗體，證明外泌體可激活免疫應答，導致產生對肺SAgs的抗體并最終導致OAD的發生。供者白細胞的清除，或無法遷移到受者淋巴組織，表明供者移植物來源的外泌體在同種異體抗原識別途徑中發揮重要作用。有研究顯示，直接識別、間接識別和半直接識別途徑在同種異體移植排斥中發揮作用。

3.1 直接識別和間接識別 在同種異體LTx中，使T細胞活化的主要方式有兩種:直接識別[供肺抗原提呈細胞(APC)刺激受者T細胞]和間接識別(受者APC刺激受者T細胞)。直接識別的基本過程是：供肺中的過客白細胞，包括APC和淋巴細胞，移植物血管與受者血管接通后，過客白細胞可進入受者血液循環或局部引流淋巴組織，受者T細胞也可進入移植物中，供者APC將其表面的抗原肽-MHC分子復合物(pMHC)直接提呈給受者的同種反應性T細胞，供其識別，引發移植排斥反應[21]。而間接識別是指供肺的MHC分子經受者APC加工和處理后，以供者抗原肽―受者MHC分子復合物的形式提呈給受者T細胞，使之活化[4]。間接識別是發生移植排斥反應的重要機制，這種排斥反應主要由CD4+T細胞和同種異體反應性抗體產生，BOS與非BOS患者相比，間接識別引起的同種異體排斥反應的頻率更高[22]。在AR早期，直接識別機制起主要作用；在AR中晚期和CR中，間接識別機制起更重要的作用[4]。

3.2 半直接識別 LTx后，受者血液循環和淋巴組織內的APC可以通過各種方式攝取供者抗原，包括吞噬作用、內吞作用或胞飲作用，并以外泌體(同種異體抗原)的形式分泌。由APC分泌的外泌體表面高度富集抗原肽-MHC分子復合物，提示它們可以作為抗原提呈囊泡(APVs)，類似于APC來提呈抗原，從而參與免疫應答[3,6]。有研究表明，外泌體以吞噬體的形式內化和分泌抗原，比DC提呈抗原肽的效率高103～104倍。外泌體維持起源APC的拓撲結構，在囊泡表面暴露MHC Ⅰ類或MHC Ⅱ類分子的胞外結構域，可能具有直接刺激CD8+或CD4+T細胞的能力。雖然游離外泌體直接刺激同種異體反應性T細胞的能力有限，但它們攜帶的p-MHC分子復合物，在APC通過吞噬或微胞飲作用內化時，可作為肽源間接啟動T細胞[22]。

樹突狀細胞(DC)是一種重要的專職性APC，可以提呈抗原，參與免疫調節，介導炎癥反應等。在原代DC和DC細胞系中已經觀察到由DC分泌的外泌體，并已成為外泌體介導的同種異體識別領域的研究重點[21]。成熟DC釋放的外泌體富集MHC分子、黏附分子和共刺激分子，能夠觸發免疫應答，未成熟DC(imDC)釋放的外泌體顯示出低水平的MHC Ⅱ/I類分子以及黏附分子和共刺激分子，具有調節功能，抑制免疫反應[23]。盡管一些研究已經證明了供者DC的重要性，但許多研究小組報道，某些同種異體移植發生AR第一周內，在受者血液循環或移植物引流淋巴組織中無法檢測到供者來源的DC，這表明在AR早期，除了直接識別途徑以外，可能存在其他機制，移植物來源的外泌體可能在同種異體抗原識別中發揮作用。

存在另一種稱為半直接識別的途徑，受者T細胞通過供者來源的外泌體被激活[3]。LTx后，受者血液循環或移植物引流淋巴組織中除了過客白細胞，供肺還會釋放外泌體，攜帶供者MHC分子的外泌體被受者APC攝取，受者APC與供者來源外泌體上的MHC分子結合，可以直接或間接地提呈供者MHC分子和其他相關抗原，這一現象被稱為異裝[24]。Lombardi等[25]證明了受者來源的DC與供者MHC分子異裝可以激活受者反應性T細胞，為移植中同種異體T細胞識別的半直接途徑奠定了基礎。隨后，在實體器官和同種異體骨髓移植中，供者MHC分子在受者APC上的存在也被證實。

有研究[26-28]也提到，外泌體參與了半直接識別途徑，同種異體皮膚、心臟移植后，移植物引流淋巴組織中，受者來源的DC和B細胞被供者來源的攜帶完整供者MHC分子的外泌體異穿；在心臟或胰島移植模型中，異裝細胞在刺激受者T細胞反應中起有效作用。然而，需要注意的是，外泌體不是被受者DC內化，而是小簇地黏附在受者DC表面，保留完整和功能良好的供者MHC分子和APC激活信號[22]。外泌體通過配體與受體特異性結合的方式與細胞相互作用，與靶細胞胞膜融合，并將其內含物“注射”到靶細胞的胞質中，外泌體中的miRNA調節靶細胞mRNA[5]。

Sharma等[29]提到帶有供者H-2分子的循環外泌體具有高水平的熱休克蛋白(HSPs)和miR-155，它們可以激活受者DC，受者DC比供者過客DC的數量多。當完整的供者H-2分子從供者轉移到受者DC，然后由受者DC提呈給T細胞時，就會發生半直接識別，這種機制使得直接和間接激活的T細胞通過相同的APC進行交叉調節。異裝的受者DC通過供者來源的外泌體提供供者H-2分子，通過半直接途徑有效激活異源反應性T細胞。

3.3 外泌體-miRNAs在LTx排斥反應中的調控作用 DSA可以誘導生成miRNA，miRNA不僅有助于合成抗體，還參與纖維蛋白的形成。外泌體包含已知的功能性miRNA，miR-182可誘導炎癥、miR-92a參與內皮激活、miR-142-5p參與抗體介導的排斥反應和miR-155促進Th-17分化、T細胞激活等等[30]。

miR-144已被證實參與了BOS的發展。與非BOS患者相比，BOS患者miR-144表達顯著增加。miR-144過表達導致TGIF1 TGF-β誘導因子同位序列1(smads的輔助抑制因子)顯著下降，Smad2、Smad4、TGF-β、成纖維細胞生長因子6和血管內皮生長因子表達增加，α-平滑肌肌動蛋白和纖維粘連蛋白水平增加，促進了肺纖維化[4]。miR-155是與炎癥相關的miRNA，在多個細胞系中有效上調Toll樣受體，是炎癥細胞因子(例如IL-17)產生的正調控因子，已被證明在LTx后CR的發展中發揮重要作用[31]。IL-17在BOS發病機制中也起著重要作用:通過多克隆抗IL-17，阻斷IL-17可顯著減少BOS病變[4]。miR-155在抗MHC誘導的OAD的發病機制中起著不可或缺的作用。研究[32]表明，給予MHC Ⅰ類抗體后，野生型小鼠肺血管和細支氣管周圍炎癥細胞浸潤，纖維化程度增加，管腔閉塞。而敲除miR-155基因的小鼠未表現出明顯病變。

阻斷來自供肺的外泌體釋放有可能防止同種異體移植排斥反應。在結核分枝桿菌感染的小鼠模型中，發現敲除了Rab27a基因的小鼠由于釋放外泌體的能力減弱，刺激T細胞的效率較低。有一些小的抑制分子如中性鞘磷脂酶抑制劑GW4869，酸性鞘磷脂酶抑制劑鹽酸丙咪嗪，可以有效地阻斷來自各種組織和細胞的外泌體誘導。但一項研究表明，雖然GW4869降低了外泌體的分泌，但它增強了更多的漿膜來源EV的分泌；Rab27a在減少外泌體分泌的同時，也可以減少一些非EV結合的可溶性因子的分泌，表明這些抑制方法可能會間接影響EV的組成和分泌，改變細胞功能[5]。同時在機體正常生理過程中，外泌體可以實現細胞間的通信，維持內環境穩定。因此我們應該只阻斷移植器官釋放外泌體，不要影響其他組織或細胞外泌體的釋放。在體外肺灌注過程中阻斷供肺的外泌體誘導，能夠減少肺損傷，改善移植器官的功能，這樣即使是邊緣肺也可以成功移植。Ravichandran等[5]提到在體外肺灌注過程中阻斷外泌體的形成和釋放是可行的。

外泌體介導AR和CR的機制尚不十分清楚，進一步深入研究這些機制對理解LTx后免疫過程的發展至關重要，并將為未來的治療和生物標志物的發現提供方向。

4 外泌體作為治療策略

研究[21]證明，EVs在妊娠期間孕婦對胎兒同種異體抗原的耐受以及實驗室嚙齒動物對同種異體肝移植耐受相關的免疫特權中發揮重要作用。在腸道、心臟、肝臟或腎臟移植模型中，外泌體與低劑量免疫抑制劑或供者特異性Treg聯合可以有效提升同種異體移植物的存活率[3]。利用外泌體治療替代免疫抑制治療，可能為處理移植后的嚴重副作用，提高異體移植存活率開辟新的前景。

外泌體也是靶向藥物遞送的有效候選物，在藥物傳遞方面，外泌體與脂質體等傳統合成材料相比具有各種優勢。外泌體介導的藥物傳遞的治療潛力仍在初步臨床試驗中(胰腺癌、急性缺血性腦卒中和結腸癌)[33]。近年來，為了克服天然外泌體的局限性，基于納米生物技術的人工外泌體不斷涌現，低免疫原性和毒性的人工外泌體可以有效運輸藥物、蛋白質和核酸等物質，外泌體的脂質雙層膜結構可以作為內容物的天然保護屏障，防止周圍酶類對運載物的分解，在LTx領域中將會起到重要作用[3]。納米生物技術的進步有利于開發人工外泌體，這可能會加速外泌體在移植領域的臨床轉化，人工外泌體因其大規模生產而具有商業優勢。未來，依靠生物技術、納米技術、化學工程和制藥行業等多學科的努力，將開發出新穎、多功能的人工外泌體，以改善醫療保健。我們對外泌體在LTx治療方面的潛力充滿信心。

5 小結

外泌體是一種重要的生物標志物，用于識別可能發生CLAD風險的LTxRs。相關研究還需要揭示來自移植器官的外泌體生物發生的新機制，以及外泌體在人LTx后CLAD發展中的不同作用，外泌體介導的同種異體識別可能為解決移植領域的新問題提供了缺失的一環。外泌體正在成為藥物輸送的有效納米載體，對靶細胞進行藥物傳遞，有望在移植領域成為一種極具開發潛力的運輸載體。