水稻賴氨酸含量測(cè)定方法改進(jìn)及其最優(yōu)動(dòng)態(tài)分類研究

陳庭木 李景芳 邢運(yùn)高 徐波 王寶祥 徐大勇

（江蘇省連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港 222006；第一作者：chentingmu@139.com；*通訊作者：xudayong3030@sina.com）

隨著生活水平的提高，人們對(duì)稻米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的需求也在提高。在稻米儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)中，賴氨酸是第一限制氨基酸，提高賴氨酸含量就提高了稻米蛋白質(zhì)的利用率[1]。高賴氨酸稻米作為肉雞的飼料，其飼喂效果也較好[2]。不同水稻品種賴氨酸含量存在顯著差異[3-4]。篩選高賴氨酸含量的品種，需要有高賴氨酸含量的種質(zhì)資源。苗桂珍[5]研究了染料結(jié)合法（國(guó)標(biāo)法，DBL）在谷類作物賴氨酸含量測(cè)定中的應(yīng)用；謝琳等[6]研究了DBL法在牛乳中賴氨酸含量的測(cè)定。由于DBL法對(duì)樣品和試劑消耗量大，工作效率較低，王紅梅等[7]將其改良成等比例、小體積反應(yīng)體系，結(jié)果證實(shí)改良后的方法并未降低試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和精度。陳巖等[8]應(yīng)用此法測(cè)定了玉米的賴氨酸含量，也獲得了較精確的結(jié)果。馮東等[9]研究了用生物傳感器測(cè)定賴氨酸含量，測(cè)定結(jié)果與DBL法間無(wú)顯著差異，但該方法對(duì)儀器依賴性強(qiáng)。DBL法是通過(guò)振蕩器振蕩來(lái)促進(jìn)酰化過(guò)程與反應(yīng)過(guò)程，由于目前超聲振蕩器已經(jīng)普及，且能顯著促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)，加快試驗(yàn)進(jìn)程，很多試驗(yàn)中將振蕩器振蕩改為超聲振蕩。應(yīng)用超聲振蕩測(cè)定稻米中賴氨酸含量尚未見報(bào)道。為此，設(shè)計(jì)了本試驗(yàn)，以簡(jiǎn)化水稻賴氨酸含量的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 適宜酰化用時(shí)反應(yīng)用時(shí)組合試驗(yàn)

以自育通過(guò)國(guó)審中粳糯品種中種香糯和矮稈早熟中秈資源中9黃（蛋白質(zhì)含量11.0%）為試驗(yàn)材料。本試驗(yàn)將國(guó)標(biāo)方法改進(jìn)為小樣試驗(yàn)，將振蕩過(guò)程全部改為超聲處理，超聲功率300 W，超聲期間不加溫，超聲時(shí)長(zhǎng)達(dá)60 min時(shí)加1袋400 mL的冰，防止超聲器水溫過(guò)高（超過(guò)50℃），探索適宜的超聲處理時(shí)間組合。

中種香糯酰化超聲用時(shí)分別為5 min、10 min，反應(yīng)用時(shí)分別為30 min、40 min、50 min、60 min、75 min和90 min，共12種組合。中9黃酰化超聲時(shí)間分別為10 min、15 min、20 min、30 min，反應(yīng)期間超聲時(shí)間分別為75 min、90 min和105 min，共12種組合。國(guó)標(biāo)法為對(duì)照（采用振蕩器振蕩，酰化時(shí)間為10 min、反應(yīng)時(shí)間120 min），每個(gè)處理3次重復(fù)。試劑添加方法參考王紅梅等[7]方法。

1.2 不同種質(zhì)資源賴氨酸含量測(cè)定

參考王紅梅等[7]方法測(cè)定供試46份資源的賴氨酸含量。振蕩處理部分修改為酰化超聲處理15 min、反應(yīng)超聲處理90 min，反應(yīng)超聲60 min時(shí)加入1袋400 mL冰于超聲器內(nèi)以降低溫度。這46份參試材料為：3150、C146、H09/sd_m F4 -1 -1、H09/sdmBC1F3 -1 -1、H09/sdmBC1F3 -2 -1、H09/sdmBC1F3 -4 -1、IR29、WH26、Y58S/粵奇絲苗F3-4-1、豐軟占、廣占63S BC6F4-1-1、廣占63S BC6F4-2-1、廣占63S BC6F4-3-1、廣占63S BC6F4-5-1、廣占63S BC6F4-6-1、廣占63S BC8F3-2-2、廣占63S/sd_m BC1F3-1-1、廣占63S/sd_m BC1F3-3-1、廣占63S/wxBC1F3-9-4、廣占63S/玉香占F3-1-1、廣占63S/玉針香F3-1-1、廣占63S/玉針香F3-2-1、合美占、黑保、黑腳占、黑珍米、黃合占、黃軟占、莉豐占、潘秈10、齊華占、五廣占、新黃占、徐R6547、徐引黑秈、揚(yáng)輻糯4號(hào)、玉桂香、玉香油占、玉香占、玉針香、粵晶絲苗/wxBC1F3-1-1、粵晶絲苗/wxBC1F3-2-1、粵農(nóng)絲苗、粵特13、粵油絲苗、早粳占。

1.3 賴氨酸含量最優(yōu)動(dòng)態(tài)聚類

采用陳庭木等[10]研究成功的最優(yōu)化算法，將分類數(shù)設(shè)為n，則分類間隔有n-1個(gè)，針對(duì)分類間隔作優(yōu)化，分類間隔初始值為等間隔設(shè)置，之后在分類指標(biāo)極小值與極大值間隨機(jī)變異，以分類方差分析的F值最大化為目標(biāo)，不斷擇優(yōu)生成新的親本群體，再執(zhí)行雜交變異與突變變異產(chǎn)生新的選種個(gè)體，重復(fù)擇優(yōu)與變異的過(guò)程，直到分類F值收斂到最大值為止，確定最終分類間隔取值，執(zhí)行分類并對(duì)分類方案進(jìn)行方差分析與t測(cè)驗(yàn)法多重比較。本文中將賴氨酸含量分為五類，即低賴氨酸、較低賴氨酸、中等賴氨酸、較高賴氨酸和高賴氨酸。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，采用單因素重復(fù)觀察模型作方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 賴氨酸含量測(cè)定方法優(yōu)化

中種香糯采用處理組合單因素方差分析，模型不顯著，且處理內(nèi)偏差較大，有多個(gè)試驗(yàn)樣本數(shù)據(jù)出現(xiàn)負(fù)值異常，說(shuō)明有些試驗(yàn)處理不合理。由圖1知，酰化5 min數(shù)據(jù)出現(xiàn)且試驗(yàn)誤差大，酰化10 min數(shù)據(jù)未出現(xiàn)異常，但反應(yīng)用時(shí)少的處理試驗(yàn)誤差仍然很大，反應(yīng)用時(shí)75 min、90 min及對(duì)照3種處理獨(dú)立作方差分析，三者間差異亦不顯著，但反應(yīng)用時(shí)90 min測(cè)得值要高于對(duì)照，誤差略大。由于中種香糯試驗(yàn)處理設(shè)置不理想，重新設(shè)計(jì)中9黃的賴氨酸含量測(cè)定試驗(yàn)。

中9黃試驗(yàn)方差分析顯示，不同處理間差異不顯著（表1）。有些處理水平試驗(yàn)誤差很大，可能與酰化不充分或反應(yīng)不充分有關(guān)，去除5組誤差較大組合，重新方差分析，模型達(dá)到顯著水準(zhǔn)。但最優(yōu)處理與對(duì)照間差異仍不顯著。由圖2可知，酰化10 min普遍測(cè)得值偏低，反應(yīng)75 min普遍測(cè)得值誤差偏大。如果酰化15 min、反應(yīng)90 min，試驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)高而誤差小。另外，酰化與反應(yīng)總用時(shí)達(dá)到105 min的處理誤差均較小，可能充分酰化最低用時(shí)15 min、反應(yīng)最低用時(shí)90 min，但反應(yīng)時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，避免因超聲器內(nèi)溫度過(guò)高增加誤差。故將最優(yōu)超聲處理時(shí)間組合設(shè)為酰化超聲15 min、反應(yīng)超聲90 min，反應(yīng)超聲60 min時(shí)加入1袋400 mL冰袋于超聲器內(nèi)降低溫度，防止溫度上升過(guò)高。

圖1 中種香糯在不同處理下賴氨酸含量測(cè)定結(jié)果

表1 不同超聲時(shí)間組合與對(duì)照間測(cè)得中9黃賴氨酸含量多重比較結(jié)果

圖2 中9黃不同處理賴氨酸含量測(cè)定值及其誤差表現(xiàn)

表2 不同資源材料賴氨酸含量

圖3 46份水稻資源材料賴氨酸含量分布

2.2 不同資源材料賴氨酸含量分布

從表2可見，46份水稻資源材料賴氨酸含量平均值為0.26%、最小值為0.06%、最大值為0.43%、標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.12%、變異系數(shù)為46.06%，賴氨酸含量變異范圍較大。

2.3 賴氨酸含量分類標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)陳庭木等[10]的輪回選擇算法，針對(duì)所研究46份樣本，分為五類，親本群體大小為100，每代經(jīng)過(guò)變異產(chǎn)生4 000個(gè)體，經(jīng)過(guò)三輪進(jìn)化計(jì)算，收斂到最終分類方案，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=454.7469，達(dá)極顯著差異，多重比較顯示，任意兩類間均差異極顯著。高賴氨酸含量品種有：H09/sdmBC1F3-4-1、廣占63S/sd_m BC1F3-1-1、廣占63S/sd_m BC1F3-3-1、合美占、黑保、黑腳占、黑珍米、莉豐占、粵農(nóng)絲苗，占比近20.0%；較高賴氨酸品種數(shù)量較多（圖3）。由獲得資源系譜可知，sdm系列雜交后代賴氨酸含量高，sd_m是中秈品種9311的矮稈突變體矮9311[11]，黑保與黑珍米是黑米品種，合美占、莉豐占、粵農(nóng)絲苗是廣東引進(jìn)優(yōu)良外觀中秈常規(guī)水稻品種。由篩選結(jié)果可以推測(cè)：一是高賴氨酸品種選育首先要選用高賴氨酸資源；二是黑米品種可能多數(shù)是高賴氨酸資源，本次試驗(yàn)僅有2份黑米資源，全歸類為高賴氨酸資源，但這一點(diǎn)有待深入試驗(yàn)證實(shí)。依據(jù)分類參數(shù)，可將含量高于0.37%的品種暫定為高賴氨酸品種。如果測(cè)定親本量足夠大，如達(dá)到1 000份以上，可能會(huì)得出更好的結(jié)果。

3 討論與結(jié)論

3.1 賴氨酸含量測(cè)定方法改進(jìn)

研究結(jié)果表明，賴氨酸含量測(cè)定中將振蕩器振蕩改為超聲振蕩處理可行，能提高測(cè)定結(jié)果同時(shí)降低誤差。本次試驗(yàn)中，在超聲300W條件下試驗(yàn)用時(shí)達(dá)到105 min，如果提高超聲功率，理論上能加速反應(yīng)過(guò)程，達(dá)到縮短試驗(yàn)過(guò)程的目的，需要對(duì)不同最大功率的超聲儀器進(jìn)行測(cè)定方法優(yōu)化。

3.2 高賴氨酸含量育種方向

高賴氨酸育種中不可避免提高水稻的蛋白質(zhì)含量，隨著蛋白質(zhì)含量的提高，水稻的適口性會(huì)降低，故高賴氨酸含量育種一般不能針對(duì)食用品種，主要用于改良米粉稻或飼用稻。米粉稻提高賴氨酸含量有助于提高配方米粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，對(duì)部分替代乳制品有良好前景。飼用稻主要是提高蛋白質(zhì)含量，以提高飼用價(jià)值。平均氨基酸總量和必需氨基酸含量都有一定的雜種優(yōu)勢(shì)[12]，故飼用稻應(yīng)采用雜交稻育種為宜，不僅提高飼用價(jià)值還能提高產(chǎn)量；大胚米中必需氨基酸與脂肪含量顯著高于普通米[13]，米粉稻中為了提高蛋白質(zhì)含量和脂肪含量，特別適合應(yīng)用高賴氨酸資源與巨胚基因結(jié)合。