多年生稻白葉枯病抗性評價

李鵬林 秦世雯 張石來 黃光福 張靜 呂建平 胡鳳益*

（1 云南大學農學院/云南省多年生稻工程技術研究中心，昆明 650504；2 云南省植保植檢站，昆明 650034；第一作者：lipenglin@mail.ynu.edu.cn；*通訊作者：hfengyi@ynu.edu.cn）

多年生稻是指種植一次可以連續收獲多年（季）的水稻，即從第2年（季）起不再需要買種、育秧、犁田耙田、栽秧等生產環節，大大減少了勞動力投入和減輕了勞動強度，是一項輕簡化的稻作生產技術。該項技術包括了多年生稻品種及配套的耕作栽培技術[1-2]。近年來，云南大學已成功利用長雄野生稻（Oryza longistaminata）地下莖無性繁殖特性培育出多年生稻品種[1-3]。其中，多年生稻23（PR23）已通過云南省審定（審定編號：滇審稻2018033號），云大24（PR24）、云大25（PR25）、云大101（PR101）、云大107（PR107）等品系也開始試驗試種。通過前期在云南省內多年多點試驗結果來看，盡管多年生稻品種（系）的父本長雄野生稻攜帶有水稻白葉枯病抗性基因Xa21[4-5]，但多年生稻品種（系）在各地的白葉枯抗性表現不一。多年生稻品種（系）是否具備白葉枯病抗性并攜帶相關抗病基因并不十分清楚，導致在多年生稻抗白葉枯病育種和生產應用上指導性不強。

因此，本研究通過田間病情調查、人工接種抗性水平鑒定和抗性基因檢測3種方法，對多年生稻品種（系）PR23、PR24、PR25、PR101、PR107及其親本長雄野生稻、RD23和F1（RD23/長雄野生稻）進行白葉枯病抗性鑒定，以明確多年生稻品種（系）的白葉枯病抗性水平，為今后多年生稻遺傳育種、生產防控，以及產業布局提供一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以PR23、PR24、PR25、PR101、PR107、長雄野生稻（多年生稻的父本）、RD23（多年生稻的母本）、F1（RD23/長雄野生稻）共計8個材料進行白葉枯病抗性鑒定。其中，長雄野生稻來源于非洲尼日爾，RD23是泰國優質秈稻，雜交后通過幼胚挽救技術獲得了F1植株，經過多世代的自交，選育出PR23、PR24、PR25、PR101、PR107等多年生稻品種（系）。

1.2 試驗地點

試驗材料于2019年種植于西雙版納州多年生稻育種基地，海拔為580 m，年平均氣溫22.6 ℃，年降水量1 200 mm。西雙版納州氣候高溫高濕，水稻生產易感染白葉枯病。田間調查在西雙版納傣族自治州示范推廣田塊進行。

1.3 田間管理

接種用品種（系）7月15日播種，8月5日移栽大田，每個品種栽4行，移栽行株距為20 cm×20 cm，單苗移栽，每行10株。示范田早稻播種期為1月15日，移栽期為3月1日，晚稻播種期和移栽期與接種用品種一致，移栽行株距為20 cm×20 cm，每叢栽1～2苗。接種田和示范田田間水肥管理參照當地大面積水稻生產田。

表1 水稻白葉枯病分級和評價標準

1.4 白葉枯病抗性鑒定

1.4.1 田間病情調查

6月、10月對西雙版納州試驗田及示范推廣田塊的PR23、PR24、PR25、PR101、PR107，以及長雄野生稻、RD23和F1（RD23/長雄野生稻）進行早稻和晚稻的田間白葉枯病病情調查，采用五點取樣調查法，病級評價參照已有標準[6]（表1）。

1.4.2 田間接種鑒定

選取9個不同致病力的水稻白葉枯病生理小種用于抗性水平鑒定，即YP1、YP2、YP3、YP4、YP5、YP6、YP7、YP8、YP9菌株（由云南農業大學植物病理研究室分離鑒定并提供）。其中，YP1為弱致病力菌株，YP6為強致病力菌株。病原菌分別于PSA培養基（馬鈴薯200 g，葡萄糖或蔗糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL）上30℃培養72 h后，配制3×108CFU/mL菌液備用。選取生長時期一致的多年生稻葉片，于15∶00、溫度為28℃～30℃時，采用剪葉法接種[7]，即剪去葉尖1～3 cm進行傷口接種。每個菌株接種4個植株，每個植株接種3～5個葉片（劍葉和上3葉）。接種21 d后調查白葉枯病發病情況。

1.4.3 抗性基因檢測

1.4.3.1 DNA制備 取0.1 g PR23、PR24、PR25、PR101、PR107、長雄野生稻、RD23、F1（RD23/長雄野生稻）的幼嫩葉片，CTAB法[8]提取其基因組DNA，置于-20℃冰箱保存備用。

1.4.3.2 PCR鑒定 基于已報道和克隆的10個抗白葉枯病基因，包括7個顯性抗病基因（Xa1、Xa3、Xa4、Xa10、Xa21、Xa23、Xa27）和3個隱性抗病基因（xa5、xa13、xa25）。利用已發表的功能標記或分子標記進行PCR擴增（表2），利用聚丙烯酰胺凝膠電泳[9]和1%～2%的瓊脂糖凝膠電泳[10]對PCR產物進行檢測。

2 結果與分析

2.1 田間病情調查

從表3可見，長雄野生稻、F1、PR101在早、晚稻全生育期對白葉枯病均表現出中抗以上抗性水平；RD23在早稻全生育期表現出中抗以上抗性水平，在晚稻的分蘗期和孕穗期表現出中感和感（表3）；5個多年生稻品種（系）均不同程度感白葉枯病，其中，PR107感病最嚴重，在早、晚稻苗期、分蘗期和孕穗期均表現出感病。

2.2 抗性水平評價

從供試菌種看，YP6菌株致病力最強，除了長雄野生稻外，能使多年生稻品種（系）以及RD23和F1均感病；YP1菌株致病力相對最弱，8個材料均對其表現出抗性（表4）。

表3 多年生稻白葉枯病田間病情調查結果

表4 多年生稻品種（系）及其親本和F1田間病情調查和抗性水平評價結果

表5 白葉枯病抗性基因在多年生稻品種（系）中的分子檢測結果

從多年生稻品種（系）看，長雄野生稻對9個供試菌種均表現出抗病；PR101對YP6菌株表現為中感，但對其他8個菌株均表現為中抗以上；PR23、PR24和PR25對9個菌株具有不同的抗性表現，對YP6、YP7、YP8、YP9菌株的感病程度與田間病情調查結果一致；PR107對除YP1外的8個菌株均表現出感病（表4）。

不同致病力生理小種的抗性水平鑒定結果雖然與田間調查結果存在一定差異，但感抗病情況基本吻合，說明該抗性水平評價結果可以直接指導田間白葉枯病害防治。

2.3 抗病基因檢測

檢測結果（表5）發現，長雄野生稻、RD23、F1、PR23、PR24、PR25、PR101和PR107具有Xa1、Xa4、Xa23和xa25等位基因，說明這些材料具有潛在的Xa1、Xa4、Xa23、xa25抗性基因。田間病情調查結果（表4）表明，RD23、PR23、PR24和PR25、PR107均感白葉枯病，而長雄野生稻、F1和PR101均抗白葉枯病，說明RD23、PR23、PR24、PR25、PR107攜帶的為感病等位基因，長雄野生稻、F1、PR101可能攜帶部分相關基因的抗病等位基因。

Xa3/Xa26基因的功能標記檢測顯示，在長雄野生稻、RD23、F1、PR23、PR25、PR101和PR107都未擴增出基因條帶，推測長雄野生稻、RD23、F1、PR23、PR25、PR101和PR107中可能不攜帶Xa3/Xa26基因。Xa21基因的功能標記檢測顯示，只有長雄野生稻中擴增出抗病基因帶型，而在RD23、F1、PR23、PR25、PR101和PR107擴增出感病基因帶型，PR24中未擴增出條帶，推測Xa21基因雖然是來源于長雄野生稻的白葉枯病抗性基因，但是沒有遺傳到其衍生的多年生稻品種（系）中。白葉枯病抗性基因xa25在RD23、PR23、PR24、PR25和PR107中為感病基因型（860 bp），且RD23、PR23、PR24、PR25和PR107均感白葉枯病，而在F1和PR101中為抗病基因型（約930 bp），推測xa25可能在F1和PR101的抗白葉枯病中起到了積極作用。Xa27基因功能標記檢測表明，在長雄野生稻、F1和PR101中擴增出了抗病基因帶型，PR107中未擴增出條帶，在RD23、PR23、PR24、PR25擴增出感病基因帶型，這與長雄野生稻、F1、PR101在田間病情調查結果相符，說明PR101可能攜帶Xa27抗病基因，起到主要抗病作用。

PR23、PR24、PR25和PR107攜帶已知的白葉枯病抗性基因Xa1、Xa4、Xa23、xa25的等位基因，但均感病，說明這幾個抗病等位基因在這些材料中為感病基因型；雖然長雄野生稻攜帶已知白葉枯病抗性基因Xa1、Xa4、xa25、Xa21、Xa23、Xa27，但從其F1及衍生的5個多年生稻品種（系）的田間病情調查結果和攜帶基因看，Xa27和xa25基因可能是由長雄野生稻遺傳給PR101并賦予其白葉枯病抗性的主要原因。

因此，PR101抗白葉枯病是由于其可能攜帶來自長雄野生稻的Xa27、xa25基因，而PR23、PR24、PR25和PR107這4個多年生稻品種（系）不具備本研究中用到的10個抗白葉枯病基因。

3 結論和討論

白葉枯病在秈稻和粳稻中發病情況具有一定差異，一般秈稻重于粳稻，晚稻重于早稻[20]。根據對不同致病力白葉枯病菌生理小種抗性水平鑒定發現，PR101對大部分白葉枯病生理小種表現出抗性，并與田間生產條件下表現一致；PR23、PR24和PR25僅對部分白葉枯病生理小種具有抗性，需要進一步進行白葉枯病抗性遺傳改良；PR107對大部分白葉枯病生理小種均感病，是制約其推廣應用的主要限制因素，急需進行白葉枯病的抗性改良。

多年生稻PR23、PR24、PR25、PR101和PR107中均不含xa5、Xa3/Xa26、xa13、Xa10、Xa21抗病等位基因。PR23、PR24、PR25和PR107攜帶白葉枯病抗性等位基因Xa1、Xa4、Xa23、xa25，但根據田間病情調查發現這幾個品系均感病，說明Xa1、Xa4、Xa23、xa25抗性等位基因在PR23、PR24、PR25、PR107中不起抗病作用；在長雄野生稻中檢測到攜帶有Xa1、Xa4、Xa21、Xa23、xa25和Xa27等白葉枯病抗性等位基因，但從其F1及衍生的5個多年生稻品種（系）的田間病情調查結果和攜帶基因看，xa25、Xa27基因可能是通過長雄野生稻遺傳到PR101的白葉枯病抗性等位基因。

xa25是一個隱性的抗白葉枯病主效基因，與其對應的顯性基因是Xa25。xa25的供體品種是明恢63，對白葉枯菌生理小種PXO339表現為專化性抗性[21]。由于xa25的啟動子突變，導致PthXo2無法被識別，則其表達便不受誘導，表現為抗性[22-23]。xa25的表達受顯性等位基因Xa25的調控。王石平等[24]通過轉基因技術將xa25的部分DNA片段導入到水稻品種中，抑制其表達從而增強水稻品種的抗性。所以猜想PR101可能是由于抑制了xa25的表達而表現為抗白葉枯病。

已有報道，白葉枯病抗性等位基因Xa27來自小粒野生稻（O.minuta）[7,25]，而來源于長雄野生稻的Xa27等位基因也可能是白葉枯病的抗性等位基因。WU等[26]發現，Xa27的表達是通過增加葉片維管束次生細胞壁厚度來抵御病原菌的侵染，推測PR101能抵抗白葉枯病可能是通過增加維管束次生細胞壁的厚度來抵御侵害。

多年生稻PR101對白葉枯病表現出良好抗性，可作為改良水稻抗白葉枯病的基因庫。深入研究多年生稻PR101對白葉枯病的抗性反應，有助于水稻白葉枯病抗病育種研究，拓寬水稻抗白葉枯病育種的材料基礎；而在利用PR23、PR24、PR25和PR107進行稻作生產時，需要注意及時有效的進行白葉枯病防治。