冬蟲夏草提取液對輻照誘導小鼠睪丸組織細胞凋亡的影響

魏閃閃，彭偉彪，汪家春，馮旭，蘇笠，張陣陣，儲智勇

隨著科學技術的進步和社會的發展，電離輻射廣泛應用于農業、工業和醫療[1]。然而，電離事故與放射醫療不可避免地會對正常組織細胞造成不良損傷，引起急性輻照綜合征。在電離輻照過程中，正常細胞及組織均會受到一定程度的損傷，進而導致DNA雙鏈的解開、凋亡等信號通路蛋白的表達，并進一步促進活性氧、活性氮、線粒體細胞色素C、促炎因子的釋放，進而造成細胞的凋亡[1-3]。

由于無細胞再生系統和抗氧化防御的活性，睪丸組織被認為是最具輻射敏感性的器官之一，輻射對生殖能力的損傷較為突出[3]。Mohsen Marzban及Sivakumar等[4-5]研究證實，電離輻射影響著精子的形成、睪丸的形態及功能，引起了睪丸細胞生長激素損傷和改變，進而致使男性不育或親代的畸形。為了減少輻射引起的睪丸損傷，人們已進行了大量的研究工作來探索可能有效的輻射保護劑。迄今為止，食品藥品監督管理局(FDA)唯一批準的放射保護劑是氨磷汀，其在放射治療期間顯示出嚴重的組織毒性，臨床上尚未出現有效治療睪丸輻射損傷的藥物[6]。

冬蟲夏草是冬蟲夏草菌和蝙蝠蛾科幼蟲的復合體，主要產于青海、西藏、四川、云南、甘肅等地，具有無毒副作用、安全可靠等重要的藥性特征[7]。古代《本草綱目拾遺》、《中藥大辭典》中均記載冬蟲夏草有補精益髓、治百虛百損等功效[7]。現代藥理學研究結果表明，冬蟲夏草可用于治療慢性肝病與腎病、癌癥、肥胖、高血壓、糖尿病、免疫力低下等多種疾病[8-10]。冬蟲夏草是一種極具潛力的中藥，然而其功效研究依然處于初步階段。本研究分析冬蟲夏草提取液(CSE)對60Coγ射線輻照小鼠睪丸組織中自由基氧化、凋亡的保護功能，以期為CSE的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥品 野生冬蟲夏草產自青海玉樹，于雷允上藥業集團有限公司購買，由海軍軍醫大學藥學院黃寶康教授鑒定為真品。冬蟲夏草提取液(CSE)由海軍醫學研究所制劑室提供(批號：20161201)，采用水提法制備：取500 g產于青海的野生冬蟲夏草原料，分別加入2.5、1.5、1 L的蒸餾水，100 ℃各提取1 h，過濾得濾液，定容至每毫升含100 mg(生藥含量)冬蟲夏草提取液，測定腺苷含量為3.334 4 mg/100 ml，置于-80 ℃冰箱中保存備用[9]。

1.1.2 實驗動物 SPF級C57BL/6雄性小鼠50只，體質量20～25 g，購自于上海西普爾必凱實驗動物有限公司，生產許可證號: SCXK(滬)2013-2016。50只小鼠放于室內溫度為22～26 ℃，濕度比例為44%～65%的動物房。給予所有小鼠正常飲食、飲水，飼養1周以適應生長。該實驗已通過海軍軍醫大學倫理委員會審核，均遵守實驗動物管理規范和適用原則。

1.1.3 動物分組 SPF級C57BL/6雄性小鼠50只，按數字表法隨機分為5組，每組10只，即低劑量CSE治療(CSE-L)組、中劑量CSE治療(CSE-M)組、高劑量CSE治療(CSE-H)組，對照(Control)組、輻照組(Model)組。輻照前，5組小鼠正常飼養。

1.1.4 試劑 生理鹽水(批號：160530D13)購于黑龍江福和華星制藥集團股份有限公司；TUNEL檢測試劑盒(貨號：11684817910)購于Roche公司；體積分數為4%的多聚甲醛(P0099)、5×Loading Buffer(P0015L)、Western 及IP裂解液(P0013)、增強型BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S)均購于碧云天公司；PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time，RR036A)、RNAiso Plus(9109)均購于Takara；SybrGreen qPCR Master Mix(QR-SG-M200)購于Rainbio公司；一抗內參蛋白GAPDH Rabbit mAb(#5174)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)Rabbit mAb(#3498)、Bax Rabbit mAb(#5023)、caspase 3 Rabbit mAb(#14220)、cleaved-caspase 3(#9661)Rabbit mAb均購于Cell Signaling Technology公司。

1.1.5 實驗儀器 ECLIPSE TI-SR倒置熒光顯微鏡(日本 NIKON公司)；ECLIPSE C1正置熒光顯微鏡(日本 NIKON公司)；Bio-Chemi DocTMTouch化學發光成像系統(美國 Bio-rad公司)、CFX96 Touch定量PCR儀(美國 Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立電離輻照損傷模型 稱量各組小鼠體質量，每隔7 d進行體質量檢測。將Model組、CSE治療組的小鼠置于帶有10個小格子塑料盒中固定，給予單次8 Gy60Coγ射線全身輻照。輻照條件為：8 Gy，輻照率為0.96 Gy/min。輻照后4 h，CSE-L、CSE-M與CSE-H組灌胃給予相應生藥劑量的CSE，CSE-L組生藥劑量312.5 mg/kg、CSE-M組生藥劑量625 mg/kg、CSE-H組生藥劑量1 250 mg/kg。同時，非治療組小鼠給予等體積量的生理鹽水。5組小鼠在相同的實驗條件下，每日于14∶00進行灌胃給藥/生理鹽水1次，共持續28 d。5組小鼠分別于輻照前2 h，輻照后第7、14、21、28天稱重并記錄。實驗結束前，Model組、CSE-L組小鼠分別死亡4只、1只，其余組的小鼠均無死亡現象出現。

1.2.2 標本收集 給藥28 d后，用150 μl的3%水合氯醛麻醉小鼠，切開小鼠陰囊后，將小鼠的2只睪丸組織取出，用生理鹽水反復清洗除去異物后，一只置于體積分數為4%的多聚甲醛中，另一只液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 TUNEL檢測小鼠睪丸組織中凋亡的生精細胞數目[7]將石蠟切片進行脫蠟，加入蛋白酶K修復，破膜，加TUNEL試劑盒試劑1與試劑2孵育，然后DAPI復染細胞核，封片，最后于正置熒光顯微鏡下觀察并采集Control組、Model組、CSE-H組小鼠組織的TUNEL染色圖像并計算凋亡的生精細胞的數目。其中DAPI顏色顯示為藍色，TUNEL顏色顯示為綠色。

1.2.4 qPCR檢測睪丸組織中凋亡相關基因的表達[10]取(10±2)mg睪丸組織至1.5 ml EP管，加入1 ml的Trizon，放于細胞粉碎機中研碎。按照5∶1比例加入氯仿，充分漩渦，靜置10 min，12 000 g離心10 min取上清至新的EP管中(離心半徑8.6 cm)，加入等量的異丙醇，輕輕混勻后靜置10 min，12 000 g離心5 min棄上清(離心半徑8.6 cm)。用無酶水配置的體積分數為75%的乙醇洗滌3次，干燥，依據沉淀量加入適量的無酶DEPC水，將沉淀彈勻即為RNA。測定RNA濃度后，定量，在20 μl體系下進行逆轉錄，于96孔PCR板中進行qPCR，并計算Control組、Model組、CSE-H組小鼠睪丸組織中Bcl-2、Bax、caspase 3基因的表達量。引物序列見表 1。

表1 PCR引物序列

1.2.5 Western blot檢測小鼠睪丸組織中凋亡相關蛋白的表達[5]稱取(20±2)mg睪丸組織，加入200 μl的Western及IP裂解液，放于細胞粉碎機中研碎，12 000×g離心10 min后取上清總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度并定量，沸水浴熱變性。將等量的蛋白進行電泳，轉膜，封閉，一抗4 ℃搖床過夜孵育，二抗避光孵育1.5 h后，放入Bio-Chemi DocTMTouch化學發光成像系統中顯影，使用Image J軟件對Control組、Model組、CSE-H組小鼠睪丸組織中的Bcl-2、Bax、caspase 3、cleaved-caspase 3蛋白進行定量分析。

1.3 統計學處理

采用Graphpad 7.0軟件對實驗數據進行分析，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CSE對60Coγ射線輻照誘導小鼠體質量的影響

與Control組相比，Model組中小鼠體質量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與Model組相比，CSE-L、CSE-M、CSE-H治療組中小鼠體質量呈劑量依賴性明顯上升(P<0.05或P<0.01)；與Control組相比，CSE-M與CSE-H治療組小鼠體質量均差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。這提示CSE對60Coγ射線輻照后小鼠體質量減輕有保護作用。

表2 8 Gy60Co γ射線輻射后不同時間各組小鼠體質量變化(g，x±s)

2.2 CSE對60Coγ射線輻照誘導小鼠睪丸組織TUNEL陽性細胞數目的影響

睪丸組織TUNEL切片中的陽性細胞即為凋亡的生精細胞。TUNEL染色結果顯示，Model組小鼠凋亡的生精細胞數目[(58.33±4.41)個]比Control組[(9.00±0.58)個]顯著增加，差異有統計學意義(P<0.01)。與Model組相比，CSE-H組小鼠睪丸組織TUNEL陽性細胞數目[(21.33±4.67)個]明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。因此，TUNEL實驗結果顯示，高濃度CSE能有效地抑制由輻照引起的睪丸組織中生精細胞的凋亡。見圖1。

注：A代表對照組，B代表模型組，C代表高劑量CSE治療(CSE-H)組。CSE為冬蟲夏草提取液圖1 CSE對8 Gy 60Co γ射線輻照小鼠睪丸組織TUNEL陽性細胞數目的影響

2.3 CSE對60Coγ射線輻照誘導小鼠睪丸組織中Bcl-2、Bax、caspase 3基因mRNA相對表達量的影響

qPCR結果所示，與Control組相比，Model組中小鼠睪丸組織中促凋亡基因Bax、caspase 3 mRNA相對表達量顯著增加，抑凋亡基因Bcl-2 mRNA相對表達量明顯降低，差異均有統率學意義(P<0.01)。與Model組相比，CSE-H組中Bax、caspase 3 mRNA相對表達水平顯著下調，Bcl-2基因mRNA相對表達水平明顯上調，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。該實驗結果表明，CSE能有效地改善上述與凋亡相關的基因表達。

2.4 CSE對60Coγ射線輻照誘導小鼠睪丸組織中Bcl-2、Bax、caspase 3、cleaved-caspase 3蛋白表達量的影響

與Control組相比，Model組中Bax、cleaved-caspase 3蛋白水平顯著上調，Bcl-2蛋白水平明顯下調，差異均有統計學意義(P<0.01)。這提示60Coγ射線輻照增強了促凋亡蛋白cleaved-caspase 3的發生。與Model組相比，CSE-H治療組中抑凋亡蛋白Bcl-2表達水平顯著升高，促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase 3表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表5。該實驗結果顯示，CSE可以逆轉由輻照引起的上述凋亡相關蛋白表達。

表5 CSE對8 Gy 60Co γ射線輻照誘導小鼠睪丸組織中Bcl-2、Bax、caspase 3、cleaved-caspase 3蛋白表達量的影響(x±s)

3 討論

冬蟲夏草具有多種生物學和藥理學功能，已被廣泛應用于性功能、生殖功能障礙[9]。目前已有體外研究表明，CSE不僅可以與正常小鼠間質細胞結合，誘導睪丸激素的產生，而且刺激MA-10小鼠睪丸間質腫瘤細胞分泌睪酮與類固醇[10]。體內實驗報道顯示，CSE可以提高未成熟和成熟B6小鼠的血漿睪酮水平，改善野豬和大鼠的精子質量和數量，從而增強雄性的性功能[10]。然而，CSE對電離輻照后的睪丸組織是否有保護作用尚不清楚[11]。因此，本課題對CSE治療輻照誘導小鼠睪丸組織損傷的潛在保護機制進行了探索。

本研究從宏觀及微觀基因蛋白調控方面，闡述了CSE保護輻照后睪丸組織損傷的分子生物學機制。電離輻照引起的最直觀的損傷為小鼠的體質量、睪丸器官指數的降低[12-13]。小鼠受到全身輻照損傷后，總體質量會顯著降低，代表此次造模成功。CSE治療后小鼠體質量明顯上升，表明CSE對輻照后的小鼠體質量減輕有顯著的改善功能。電離輻照會增加氧化自由基的釋放與DNA的損傷，從而導致細胞凋亡及組織結構的損傷[13-14]。為深入探索CSE對電離輻照的保護作用機制，本研究通過采用TUNEL染色來探討睪丸組織電離損傷細胞凋亡情況。TUNEL染色結果顯示，Model組小鼠睪丸組織中陽性細胞數目增加，CSE治療后凋亡細胞數目減少，提示CSE降低了輻照后小鼠睪丸組織中凋亡的生精細胞數目，其作用機制可能與抗凋亡相關。

既往有研究認為，電離輻射主要通過產生細胞毒性，促使一系列的調控基因、蛋白表達，從而產生了細胞凋亡[6]。60Coγ射線輻照后，作用于pro-caspase 9，啟動了線粒體通路釋放更多的細胞色素C[14]。同時，pro-caspase 9能夠與細胞色素C及信號分子Apaf-1結合形成復合物，自身被剪切成cleaved-caspase 9，從而進一步激活下游Bax、Bcl-2、cleaved-caspase 3蛋白，導致了細胞凋亡[15-16]。qPCR與Western blot實驗結果顯示，CSE-H組與Model組相比，能顯著上調Bcl-2基因與蛋白表達，下調Bax蛋白表達。此外，CSE治療后，促凋亡基因Bax、caspase 3 mRNA相對表達量下降，促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase 3表達量下降。該結果表明，CSE保護睪丸組織可能是通過抑制線粒體凋亡通路來起作用的。

綜上所述，CSE對60Coγ射線輻照后的小鼠睪丸組織損傷有明顯的改善作用，其保護機制可能與降低小鼠睪丸組織的細胞凋亡，下調促凋亡相關基因與蛋白表達，以及上調抑凋亡相關基因與蛋白表達有關。這為研究輻照引起的生殖器官損傷提供了新的思路，可能為臨床治療因輻照引起的男性生殖系統功能障礙提供了新的治療手段。