外泌體在腎臟疾病中的研究進展

何星，王富博，葉華茂

外泌體是一種大小為40～160 nm的細胞外囊泡，包含有多種諸如核酸、蛋白質、脂類、氨基酸、小分子代謝物等內容物，這些內容物可以反映其細胞來源。此外，外泌體還可以將內容物轉運到靶細胞，成為細胞與細胞之間信息傳遞的重要媒介。外泌體在體液中廣泛存在。有研究通過分析腎單位不同節段的外泌體成分及其與腎臟生理和病理生理的相關性，驗證了與腎臟疾病相關的來自血清、腎小管細胞、腎實質細胞、腎小球內皮細胞、間充質干細胞、泌尿系統干細胞、癌細胞和巨噬細胞的外泌體的來源與作用[1-2]，說明外泌體廣泛參與了多種腎臟疾病的發生與發展。本文就外泌體在腎臟生理學和腎臟疾病的分子機制、診斷和治療中的作用等方面進行綜述。

1 外泌體在腎臟生理學中的作用

腎臟是維持內環境穩態的重要器官之一。外泌體在腎單位細胞間通訊中發揮著重要作用[2]。蛋白質組學研究表明，腎單位中的外泌體主要來自位于近曲小管、髓攀升支粗段、遠曲小管和集合管的腎小球足細胞和腎小管細胞。不僅如此，尿液外泌體中富含的多種蛋白質和轉運蛋白均來自于腎單位中的細胞。例如，來自腎小球足細胞的足糖萼蛋白、來自近曲小管的水通道蛋白(aquaporin，AQP)-1、來自髓袢升支粗段的2型Na+-K+-2Cl-同向轉運體、來自遠曲小管的Na+-Cl-同向轉運體以及來自集合管的AQP-2蛋白[3]。這些研究表明，腎單位中的外泌體來源于腎單位中的不同細胞，而且包含有這些細胞中的重要信息分子。

研究發現，集合管細胞在血管加壓素類似物作用下，其外泌體中AQP-2表達升高，從而誘導鄰近細胞上調AQP-2的表達以增強水的重吸收[4]。Gildea等[5]研究發現，腎小球足細胞的外泌體可沿近曲小管將信息傳遞至遠曲小管上皮細胞。用非諾多泮(多巴胺受體激動劑)處理近曲小管細胞后產生的外泌體可以轉移到遠曲小管和集合管，并進一步調節該部位細胞活性氧的產生。因此，在腎臟生理中，外泌體作為細胞間傳遞信息的媒介，可以將生物活性分子從近端腎小管細胞傳遞到遠端小管細胞并發揮激活效應細胞的作用。

2 外泌體與腎臟疾病

外泌體在腎臟疾病的發生和發展中起著重要作用，對于外泌體的研究不僅能夠進一步闡述腎臟疾病的分子機制，還能為腎臟疾病的分子診斷、預后判斷和治療提供新的思路和方法。

2.1 外泌體在急性腎臟損傷中的研究進展 急性腎臟損傷機體的尿液外泌體中含有相關致病分子、生物標志物和治療因子。對急性腎臟損傷致病機理和生物標志物的研究發現，缺血再灌注誘導的急性腎臟損傷可降低大鼠尿液外泌體中AQP-1、AQP-2的mRNA表達水平。AQP表達水平的降低可能會影響腎單位中水的重吸收，并與急性腎臟損傷的病程進展相關[6]。另外，大鼠的尿液外泌體miRNAs可用于判斷缺血再灌注誘導的急性腎臟損傷的病程進展。該研究發現，在早期損傷階段可檢測到外泌體miR-16、miR-24和miR-200c水平升高，而在晚期纖維化階段則發現miR-125和miR-351水平升高[7]。Sonoda等[8]發現順鉑誘導的急性腎臟損傷小鼠模型的尿液外泌體中胎球蛋白A水平升高，但AQP-2水平降低。這些研究表明，尿液外泌體中相關信號分子可用于急性腎臟損傷的分子診斷和預后判斷。

間充質干細胞來源的外泌體具有治療效果，能夠減輕急性腎臟損傷的病變程度。通過給予人臍帶Wharton′s jelly來源的間充質干細胞分泌的外泌體可減輕大鼠缺血再灌注引起的急性腎損傷并改善腎功能[9]。間充質干細胞外泌體C-C模體趨化因子受體2(C-C motif chemokine receptor-2，CCR2)含量增高并能夠降低其配體——CCL2的水平，從而抑制后者在小鼠缺血再灌注誘導的急性腎臟損傷中誘導巨噬細胞浸潤的作用[10]。骨髓間充質干細胞來源的外泌體富含miR-199a-3p，可以通過增加miR-199a-3p在腎細胞中的表達水平從而預防缺血再灌注誘導的急性腎臟損傷。此外，向大鼠靜脈注射腎小管細胞外泌體可以改善局部缺血誘導的腎損傷[11]。這些研究表明，間充質干細胞或腎臟細胞來源的外泌體可能改善腎損傷的預后，這為急性腎損傷的預防和治療提供了新的方法。

2.2 外泌體在腎移植排斥反應中的研究進展 目前，腎臟活檢是診斷腎移植排斥反應的金標準。然而，這種有創診斷技術常常會造成血尿等諸多活檢相關并發癥。外泌體中潛在的生物標志物或可更便捷地診斷細胞和抗體介導的同種異體移植反應。T細胞浸潤是診斷腎移植后急性細胞排斥反應的標志之一。發生急性細胞排斥反應的患者尿液的外泌體中檢測到CD3強陽性，這可能提示腎同種異體移植中T細胞的浸潤[12]。對于抗體介導的排斥反應，在同種異體移植排斥反應患者的血漿外泌體中發現糖蛋白130(glycoprotein 130，gp130)、CCL4、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis fact￣or，TNF-α)、含SH2結構域蛋白1B (SH2 domain containing 1B，SH2D1B)、小窩蛋白1(caveolin 1，CAV1)和非典型趨化因子受體1的mRNA水平升高[13]。

外泌體有助于揭示腎臟移植后的病理變化。有學者發現，宿主在接受腎移植后出現蛋白尿，其尿液外泌體γ上皮鈉離子通道(epithelial sodium channel，ENaC)的50 kDa和75kDa亞基含量升高，并與出現的高血壓有相關性[14]。此外，有患者腎臟移植后第1天尿液外泌體AQP-2含量下降，伴有尿量增加和尿滲透壓降低，但尿液外泌體AQP-2含量在移植后第6天恢復，這提示腎移植后AQP-2的一過性下降和腎小管水重吸收功能受損可能是導致移植后的急性利尿反應的重要原因[15]。

外泌體還可用于監測免疫抑制藥物的毒性。在使用環孢素-A的腎移植患者中發現尿液外泌體Na+-K+-2Cl-同向轉運蛋白增加，合并高血壓的腎臟移植患者接受他克莫司治療后，尿液外泌體Na+-Cl-同向轉運蛋白的含量也出現升高[16]。這2種轉運蛋白含量的升高均與高血壓相關，而高血壓是腎臟移植后免疫抑制治療期間的常見并發癥。

總體而言，外泌體含有眾多的分子標志物與腎臟移植相關。移植后早期對外泌體的檢測可能有助于臨床醫生更好地判斷異體移植腎的功能狀態。

2.3 外泌體在腎細胞癌中的研究進展 外泌體為腎細胞癌的早期診斷和預后判斷提供重要的線索。蛋白質組學研究發現，腎細胞癌患者尿液外泌體基質金屬蛋白酶9、血漿銅藍蛋白、足糖萼蛋白、阻黑體4(dickkopf-related protein 4，DKK4)和碳酸酐酶IX增加，而AQP-1、細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子、中性溶酶、二肽酶-1和多配體聚糖結合蛋白1減少[17]。Butz等[18]發現與正常人相比，腎透明細胞癌患者尿液外泌體miR-126-3p與miR-449a或miR-34b-5p同時升高。與腎臟良性占位病變相比，腎透明細胞癌患者尿液外泌體miR-126-3p與miR-486-5p同時升高。此外，臨床研究表明，血清外泌體miR-224和miR-210可以作為診斷腎透明細胞癌生物標志物[19]。因此，體液外泌體有望作為一種良好的腎細胞癌的早期診斷和預后判斷的分子標志物，可對患者進行無創、實時、可重復的監測。

另外，外泌體在腎細胞癌的進展中也發揮著重要的作用。一項體外實驗發現，腎透明細胞癌患者原代細胞和腎細胞癌細胞系外泌體轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)β1水平升高，進而導致自然殺傷細胞功能障礙[20]。Wang等[21]發現患者的腫瘤干細胞外泌體能促進腎透明細胞癌的增殖和上皮間質轉化，CD103陽性的外泌體可作為轉移性腎透明細胞癌的生物標志物。腎細胞癌細胞外泌體與粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細胞介素(IL)-12共同刺激的CD8+T細胞具有自體抗癌效應[22]。

2.4 外泌體在腎臟結石病中的研究進展 腎結石的形成不僅與尿液晶體過飽和相關，還與尿液晶體、蛋白質、外泌體、膠原纖維和細胞之間的相互作用有關。結石附著部位的腎乳頭組織在電鏡下可見許多有核磷酸鈣晶體的外泌體生長。

炎癥狀態中巨噬細胞等相關細胞的富集有助于形成結石基質。有研究檢測了巨噬細胞在鈣鹽處理后其外泌體中蛋白組學的變化，并進行了蛋白功能測定，結果發現，巨噬細胞外泌體中參與免疫調節(如參與T細胞活化、內環境穩態和細胞遷移等)的蛋白質含量出現改變；ELISA結果顯示，巨噬細胞外泌體IL-1β(炎癥小體活化的標志)含量增加。進一步的功能測定結果顯示，鈣鹽處理后外泌體增加了巨噬細胞的吞噬活性。為進一步分析蛋白質組的變化與免疫功能的關系，作者發現通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制波形蛋白(外泌體中含量明顯升高的一種蛋白)的表達可以消除巨噬細胞外泌體對單核細胞、T細胞遷移和巨噬細胞吞噬活性的影響，這進一步證實了外泌體波形蛋白能夠參與免疫細胞募集和增強巨噬細胞吞噬活性[23]。另有研究發現，巨噬細胞經鈣處理后產生的外泌體中有26種蛋白質含量發生改變，而未經鈣處理的巨噬細胞外泌體則無此改變。這些發生改變的蛋白質主要參與細胞骨架和肌動蛋白結合、鈣結合、應激反應、轉錄調節、免疫應答和細胞外基質降解。進一步的功能測定結果發現，巨噬細胞經鈣處理后產生的外泌體使腎小管細胞過表達IL-8并促進中性粒細胞遷移。此外，巨噬細胞經鈣處理后產生的外泌體更容易釋放出內容物以激活炎癥，這些外泌體能緊密結合鈣鹽結晶，隨后在細胞外基質不斷累積[24]。這些發現表明，巨噬細胞外泌體在多方面參與了腎小管細胞的炎癥級聯反應，從而促進腎結石的形成。

2.5 外泌體在狼瘡性腎炎和其他腎小球疾病中的研究進展 尿液外泌體檢查是一種無創的生物標志物檢查方法，可以用于多種腎小球疾病的嚴重程度和疾病預后的評估。狼瘡性腎炎小鼠模型實驗發現，隨著腎小球損傷的進行性加重，miR-26a在尿液外泌體中的含量也逐漸增加并通過調節足細胞分化而維持細胞骨架完整性。因此，其有望成為腎小球腎炎中足細胞受損的標志物[25]。炎性miRNA(如let-7a和miR-21)在狼瘡性腎炎患者的尿液外泌體中含量降低，故可作為狼瘡性腎炎臨床分期的一項指標[26]。和正常人相比，活動性狼瘡性腎炎IV類患者尿液外泌體miR-3135b升高，而miR-654-5p僅在形成新月體的狼瘡性腎炎IV類患者中升高[27]。

此外，外泌體mRNA和miRNA也是腎小球疾病的重要檢測指標。例如，局灶性節段性腎小球硬化癥患兒尿液外泌體miR-193a含量高于腎病綜合征患兒[28]。IgA腎病患者尿液外泌體中CCL2的mRNA水平升高，并且與疾病活動性相關[29]。此外，有報道稱特發性腎病綜合征患兒的尿液外泌體中有30種miRNAs含量明顯增加，其中miR-194-5p、miR-23b-3p含量與尿蛋白水平具有較明顯的相關性[30]。因此，通過對尿液外泌體中相關分子分析或可進一步確定腎小球疾病診斷和預后的分子標志物。

2.6 外泌體在慢性腎臟病中的研究進展 外泌體在糖尿病腎病和腎纖維化等慢性腎臟病的疾病發生發展過程中發揮著重要作用。研究表明，1型糖尿病腎病與尿液外泌體中纖溶酶、前列腺素和尿激酶的增加相關，同時也與ENaC的蛋白水解有關，這可能導致鈉潴留和高血壓[31]。高糖條件培養的腎小球內皮細胞產生的外泌體能夠促進糖尿病腎病腎小球系膜細胞和足細胞的上皮間質轉化和纖維化，高血糖促進巨噬細胞外泌體的分泌，繼而引起腎小球系膜增生并激活腎組織炎癥級聯反應，敲除TGF-β1后可以減弱該種作用，這表明TGF-β1可能是巨噬細胞與腎細胞之間相互作用的重要媒介[32]。一項蛋白質組學研究將糖尿病腎病患者與正常人的尿液外泌體進行了比較，結果顯示糖尿病腎病患者尿液外泌體雙庫尼茨抑制劑前體和組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶升高，而電壓依賴性陰離子選擇性通道蛋白1降低，這可能有助于糖尿病腎病診斷和病情監測。糖尿病腎病患者尿液外泌體中也檢測到AQP-2和AQP-5升高，表明這些蛋白可以作為診斷糖尿病腎病生物標志物[33]。miRNA微陣列轉錄組學研究發現與2型糖尿病患者和正常人對比，2型糖尿病腎病患者尿液外泌體中共檢測到16種miRNA含量異常。其中大部分miRNA僅在出現微量白蛋白尿的糖尿病腎病患者中能檢測到，通過qRT-PCR證明miR-320c和miR-6068與尿白蛋白排泄率具有明顯的相關性。同時發現miR-320c可能通過作用于血小板反應蛋白-1而影響TGF-β信號通路，因而其有望作為2型糖尿病腎病病情監測的生物標志物[34]。因此，這些指標或可作為診斷2型糖尿病腎病的生物標志物。

研究發現慢性腎臟病患者的尿液外泌體miR-29c和miR-181a降低，并與疾病病程或腎纖維化相關[35]。Jiang等[36]發現骨髓間充質干細胞來源的外泌體通過調節細胞間粘附分子-1的表達來抑制樹突狀細胞向腎臟的浸潤，該外泌體還能抑制腎纖維化并降低促炎細胞因子(TNF-α和TGF-β1)的水平，此外，來自泌尿系統干細胞的外泌體含有生長因子、TGF-β1、血管生成素和骨形態發生蛋白-7，它們可能在糖尿病腎病的早期參與血管再生和細胞增殖。這些研究表明，利用外泌體有望對糖尿病腎病和腎纖維化等慢性腎臟病進行治療干預。

3 結論與展望

隨著研究的深入，外泌體必將會在腎臟疾病的診斷和治療方面發揮越來越重要的作用。與常規的生物標志物相比，外泌體富含核酸、蛋白質、氨基酸、脂類、代謝產物等特定的生物標志物，其可從分子水平反映腎臟疾病的遺傳、代謝等病理生物學信息，有助于腎臟疾病的特異性診斷；外泌體內生物標志物含量及分布穩定，測量的可重復性強，有助于對腎臟疾病進行無創、實時、可重復的監測；外泌體內分子的動態變化亦可反映腎臟疾病的發展和轉歸，能夠為腎臟疾病的預后提供良好的標志物。雖然外泌體在疾病治療方面顯現出了諸多優勢，但外泌體目前并沒有在腎臟疾病有實質性的臨床應用，后續仍需進行大量的基礎研究和臨床試驗。

目前對于外泌體在腎臟疾病中的應用也面臨著各種挑戰。首先，由于某些成分(例如高密度脂蛋白、乳糜微粒和微囊泡)的大小與外泌體相近，因此分離或純化外泌體仍具有挑戰性。其次，用于腎臟疾病“液體活檢”的外泌體，其來源復雜，如何分離和鑒定出特定疾病來源的外泌體，提高其診斷的特異性仍然是目前亟待解決的問題。最后，外泌體在各種腎臟疾病發生和發展中的分子機制仍需進一步闡明。