蘆薈的HPLC指紋圖譜建立、化學模式識別分析及其含量測定

嚴雅慧，李淑萍，熱依木古麗·阿布都拉，阿吉艾克拜爾·艾薩*

1中國科學院大學，北京 100049；2中國科學院干旱區植物資源化學重點實驗室中國科學院新疆理化技術研究所，烏魯木齊 830011

蘆薈為重要的可食用的藥材，是百合科蘆薈屬多年生常綠肉質草本植物，性寒味苦，古方中記載其具有清肝熱、通便、散結、療癬等作用。蘆薈總共有500多個品種，其中庫拉索蘆薈(Aloevera(L.) Burm.f.)是最常用的藥用品種，其制品也廣泛應用于食品(包含保健食品)、藥品、化妝品等多個領域[1]。近年來，國內外蘆薈的研究工作主要集中在品種的對比分析[2,3]、分離純化[4,5]、質譜分析[6,7]、含量測定[8,9]和藥理作用[10,11]等方面。研究證明，蘆薈的主要活性成分為蒽酮類、蒽醌類和色酮類化合物，此外還有多糖類及糖苷、氨基酸、有機酸等化學成分[12,13]，具有抑菌、消炎、抗腫瘤、抗病毒、抗過敏等活性[14-16]。

目前，指紋圖譜結合化學模式識別是評價中藥材質量的有效手段。指紋圖譜主要關注藥材的整體性，建立共有模式，識別共有峰，能夠客觀、全面揭示藥材中可能的活性成分種類和數量；而化學模式識別技術則強調的是藥材之間差異性，通過對指紋圖譜數據信息的整合和校正，進一步縮小藥材活性成分的范圍；兩者結合可實現藥材的整體描述到個體分析的過程，可更加準確、客觀地反映中藥的質量差異[17,18]。蘆薈藥材主要藥用成分以蘆薈苷、蘆薈大黃素等化合物為主[19]，但功效成分及其含量隨藥材產地、生長環境、土壤及采摘季節等因素而不同，給蘆薈藥材品質及安全性的評價帶來了一定的困難。此外，《中國藥典》(2020版)[20]中蘆薈藥材的含量測定項目以蘆薈苷含量來制定，指標成分單一，難以控制藥材質量。因此，在生產和開發蘆薈藥材相關制劑之前，對蘆薈藥材進行指紋圖譜和結合化學模式識別研究是必不可少的。

本研究采用高效液相色譜(HPLC)法建立12批次不同產地的蘆薈藥材的指紋圖譜，并結合相似度分析、聚類分析、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)研究其化學組分特征，篩選出能影響藥材質量差異的標志物，并用相同的方法測定12批蘆薈藥材中6個標志物(蘆薈新苷D、蘆薈苷A、蘆薈苷B、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苦素和蘆薈大黃素)的含量，旨在從生產源頭確保藥材品質，為蘆薈藥材質量控制和標準完善提供科學依據。

1 實驗儀器與材料

1.1 儀器

美國Water 2695液相色譜儀(包括自動進樣器，DAD紫外檢測器；Empower色譜工作站，四元梯度泵，在線過濾器，柱溫箱);BT25S型電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);SQP型電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);SK7210 HP型超聲波(上海科導超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

對照品：蘆薈苦素(批號：19011601)、蘆薈新苷D(批號：19091701)、蘆薈苷B(批號：19030501)、蘆薈苷A(批號：19030204)、蘆薈大黃素(批號：19010803)、7-O-甲基蘆薈新甙A(批號：19101301)均采購于上海純優生物科技有限公司，以上對照品純度均 ≥ 97.5%。

甲醇和乙腈均為色譜純(Merck公司，Darmstadt，德國)；磷酸和甲醇為分析純(天津市光復精細化工研究所)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；其他所有試劑均為分析純。

12批蘆薈藥材來源于廣東、廣西、海南和四川4個省份，其中S1、S2、S7來源于四川省，S10～S12來源于廣西省，S3～S5來源于廣東省，S6、S8、S9來源于海南省。經中國科學院新疆理化技術研究所劉戈宇研究員鑒定為庫拉索蘆薈Aloevera(L.) Burm.f.的濃縮物。

2 實驗方法與結果

2.1 HPLC指紋圖譜建立

2.1.1 樣品制備

參照中國藥典方法[25]略微改動，取蘆薈藥材粉末(過5號篩)50 mg，精密稱定，精密加入50%甲醇75 mL，稱定重量，超聲處理(40 kH，700 W，25 ℃)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇水補足減失的重量，搖勻，分析前過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取各對照品適量，精密稱定，置于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成對照溶液：蘆薈苦素(316 μg/mL)、蘆薈新苷D(524 μg/mL)、7-O-甲基蘆薈新甙A(228 μg/mL)、蘆薈苷B(508 μg/mL)、蘆薈苷A(506 μg/mL)、蘆薈大黃素(436 μg/mL)，精密量取各對照溶液按一定比例混合配制成不同濃度的6份混合對照溶液，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜備用，-20 ℃避光保存。

2.1.3 色譜條件

HPLC色譜柱：Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex Inc.，CA，USA)，流動相溶劑A：0.3%(V/V)磷酸水溶液，B：乙腈，C：甲醇，流速是1 mL/min，進樣10 μL，柱溫35 ℃，檢測波長為254 nm，最佳梯度洗脫如下：0～8 min，88%A+10%B+2%C；8～10 min，74%A+10%B+16%C；10～45 min，58%A+10%B+32%C；45～80 min，55% A+10%B+35%C。

2.2 指紋圖譜的方法學考察

2.2.1 精密度

取編號S1的樣品，按“2.1.1”項下處理，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣6次，記錄液相色譜圖。以15號色譜峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD<0.19%，相對峰面積的RSD<0.89%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩定性

取編號S1的樣品，按“2.1.1”項下處理，按“2.1.3”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、18、24、48 h進樣，記錄液相色譜圖。以15號色譜峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD<0.87%，相對峰面積的RSD<2.67%(n=8)，表明樣品溶液在48 h內穩定性良好。

2.2.3 重復性

取編號S1的樣品，精密稱取6份，按“2.1.1”項下處理，按“2.1.3”項下色譜條件進行測定，記錄液相色譜圖。以15號色譜峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD<0.42%，相對峰面積的RSD<2.66%(n=6)，表明方法重現性良好。

2.3 指紋圖譜的生成

12批蘆薈藥材按“2.1.1”方法制備，再按“2.1.3”色譜條件進樣測定，記錄液相色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012 A版)》，以S1為參照圖譜，采用中位數法、時間窗寬度設為0.1 min建立對照圖譜，用多點校正Mark峰匹配，建立12批蘆薈藥材樣品的指紋圖譜。疊加指紋圖譜、參照圖以及共有峰標記均見圖1。

圖1 12批蘆薈藥材的指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 12 batches of aloe

圖2 蘆薈樣品(a)和混合對照品溶液(b)HPLC 圖Fig.2 HPLC chromatograms of sample (a) of aloe and mixed reference substances (b)注：1：蘆薈苦素；2：蘆薈新苷D；3：7-O-甲基蘆薈新甙A；4：蘆薈苷B；5：蘆薈苷A；6：蘆薈大黃素。Note:1:Aloesin;2:Aloeresin D;3:7-O-Methylaloeresin A;4:Aloin B;5:Aloin A;6:Aloe-emodin.

2.3.1 共有峰的指認

從12批蘆薈藥材中標定了23個共有峰，通過與對照品比對，指認出6個成分，分別是3號峰為蘆薈苦素、12號峰為蘆薈新苷D、13號峰為7-O-甲基蘆薈新甙A、14號峰為蘆薈苷B、15號峰為蘆薈苷A、23號峰為蘆薈大黃素。蘆薈樣品和混合對照品的HPLC圖譜見圖2。結果表明12批蘆薈藥材中23個共有峰的相對保留時間RSD為0%～0.55%，相對峰面積RSD為16.54%～97.02%，表明方法穩定，但不同產地的蘆薈藥材中成分含量差異較大。

2.3.2 相似度分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012 A版)》軟件建立12批蘆薈藥材共有模式的指紋圖譜，其相似度評價見表1。除產地是廣西的S10～S12樣品相似度小于0.5外，其余樣品的相似度均>0.93。

表1 12批蘆薈藥材指紋圖譜的相似度評價表

圖3 12批蘆薈藥材的聚類分析樹狀圖 Fig.3 Hierarchical cluster analysis plot for 12 batches of aloe

2.4 化學模式識別分析

2.4.1 聚類分析

以12批蘆薈藥材中23個共有峰的峰面積為變量，運用SPSS 26.0統計軟件，以組間聯接平方歐式距離測度的方式進行聚類分析，結果見圖3。由圖3可知，12批蘆薈藥材樣品明顯聚為三類，S1、S2、S7聚為第一類，S10～S12聚為第二類，S3～S6、S8、S9聚為第三類。

2.4.2 主成分分析(PCA)

采用SPSS 26.0 統計學軟件對12批蘆薈藥材中23個共有峰的峰面積進行標準化處理，計算相關矩陣的特征值即方差貢獻率，以特征值>1為標準，得到了前4個主成分的累積方差貢獻率為87.593%，能夠較好的代表指紋圖譜中的大部分信息。從成分載荷矩陣表可以看出，第一主成分的獨立方差貢獻率為39.529%，主要反映色譜峰7～9、11～15、17、18、22的信息；第二主成分的獨立方差貢獻率為26.749%，主要反映色譜峰1、2、4、6、10、16、19、21、23的信息；第三主成分的獨立方差貢獻率為14.833%，主要反映色譜峰3、20的信息；第四主成分的獨立方差貢獻率為6.482%，主要反映色譜峰 5的信息。利用SIMCA 14.1分析軟件繪制主成分得分圖，見圖4。結果表明12批蘆薈藥材大致可被分為三類，S1、S2、S7在主成分得分圖的中間分為第一類；S10～S12在主成分得分圖的左側分為第二類，S3～S6、S8、S9在主成分得分圖的右側分為第三類，其結果與聚類分析結果一致，也驗證了聚類分析的分類結果。

圖4 主成分分析得分圖Fig.4 Score scatter plot of PCA

2.4.3 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)

正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)是常用來處理分類和判別問題的一種非常有效的監督分析方法。而OPLS-DA模型的擬合效果評價指標主要是累積解釋能力參數(R2X、R2Y)和預測能力參數(Q2)，如果R2X、R2Y和Q2均大于0.5，且數值越接近于1，則表示模型擬合效果越好[17]。采用SMICA 14.1軟件對12批蘆薈藥材共有峰進行OPLS-DA分析，擬合的模型R2X=0.929，R2Y=0.939，Q2=0.835，均大于0.8，表示擬合的預測模型穩定、可靠，可用來評價蘆薈藥材指紋圖譜的模式識別方法，其得分散點圖見圖5。由圖5可知，廣西和四川產區的樣品各自聚為一類；廣東和海南產區的樣品聚為一類，說明這兩個產區藥材的化學成分相似性很高。以變量投影重要性(VIP)值大于1為依據，篩選對分組結果產生較大影響的色譜峰，結果見圖6。由圖6可知，VIP值大于1的色譜峰從大到小分別為12號峰(蘆薈新苷D，VIP值為2.982 3)、15號峰(蘆薈苷A，VIP值為1.971 5)、13號峰(7-O-甲基蘆薈新甙A，VIP值為1.691 5)、14號峰(蘆薈苷B，VIP值為1.540 1)、3號峰(蘆薈苦素，VIP值為1.523 5)，表明這5個化合物是影響蘆薈藥材質量差異的標志物。

圖5 OPLS-DA得分散點圖Fig.5 Score scatter plot of OPLS-DA

圖6 12批蘆薈藥材OPLS-DA模型中共有峰的VIP值Fig.6 VIP values of common peaks in OPLS-DA model of 12 batches of aloe

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件、樣品溶液制備和混合對照品溶液制備

同“2.1”一致，樣品和混合對照品見圖2。

2.5.2 線性關系、檢測限和定量限

分別精密吸取“2.1.2”項下6個對照品貯備液適量，混合，加甲醇定容、稀釋，制成一系列不同濃度的混合對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度(x，μg/mL)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行回歸分析，結果見表2。分別精密吸取對照品溶液適量，加甲醇稀釋，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限、檢測限。結果表明，蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷 B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的標準曲線在其各自的線性范圍內均具有良好的線性關系，相關系數R2均≥0.999 5，檢測限范圍在0.017 4～0.314 0 μg/mL，定量限范圍在0.034 9～0.559 0 μg/mL，結果見表2。

2.5.3 精密度、穩定性、重復性和回收率

精密度試驗：取樣品(S1)，按“2.1.1”方法制備樣品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素峰面積的RSD分別為0.69%、0.75%、0.64%、1.22%、0.99%、1.13%(n=6)，表明儀器精密度良好。

表2 6個指標成分的線性方程、相關系數、線性范圍、檢測限和定量限

穩定性試驗：取樣品(S1)，按“2.1.1”方法制備樣品溶液，置于室溫儲存，按“2.1.3”色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24、48 h進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素峰面積的RSD分別為1.92%、2.59%、2.73%、2.93%、2.46%、2.15%(n=8)，表明蘆薈樣品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取樣品(S1)，精密稱取6份，按“2.1.1”方法制備樣品溶液，按“2.1.3”色譜條件進樣測定，記錄峰面積計算樣品含量。結果顯示，蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素平均含量分別為8.42、167.28、18.62、109.60、191.91、24.02 mg/g，含量的RSD分別為0.88%、0.72%、2.13%、1.30%、1.48%、1.95%(n=6)，表明方法重現性良好。

加樣回收率試驗：取樣品(S1)藥材粉末(過5號篩)25 mg，按照樣品中蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的含有量與混合對照品比例1∶1精密加入，后續處理同“2.1.1”項。按“2.1.3”色譜條件進行測定，計算回收率。蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的平均加樣回收率分別為99.00%、91.45%、97.93%、94.70%、96.41%、95.34%，其RSD值分別為1.16%、0.86%、0.98%、1.13%、1.22%、1.94%(n=6)品的回收率良好，結果見表3。

表3 加樣回收率結果(n=6)

續表3

2.5.4 樣品含量測定

采用“2.1.3”項下的色譜方法，測定了12批蘆薈藥材中蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A、蘆薈苷B、蘆薈苷A和蘆薈大黃素的含量，每個樣品做3個平行，結果見表4。

由表4可知，廣東、海南和四川產區的6個指標成分總含量達到519.87～688.87 mg/g以上，而廣西產區僅達到371.31～442.73 mg/g。12批藥材中6個指標成分含量對比，蘆薈苦素、蘆薈新苷D、7-O-甲基蘆薈新甙A的相對含量差異較大，分別為0.55～13.47、7.98～369.88、1.36～25.44 mg/g；蘆薈苷B、A和蘆薈大黃素的含量差異相對較小，含量分別為65.14～150.08、109.51～263.16、18.30～40.32 mg/g。其中廣西產區的樣品，蘆薈新苷D的平均含量(9.70 mg/g)遠低于廣東產區(293.97 mg/g)、海南產區(293.57 mg/g)和四川產區(257.81 mg/g)的平均值，但蘆薈苷B(142.58 mg/g)和A(237.08 mg/g)的平均含量均高于廣東產區(110.21、195.79 mg/g)、海南產區(102.80、179.87 mg/g)和四川產區(97.17、170.48mg/g)的平均值。

3 討論

本研究比較了熱回流法和超聲法對特征色譜峰提取率的影響。結果發現，超聲處理提取效率高、時間短、損失少，易操作。同時分別考察了提取溶劑(甲醇、乙醇)及濃度、提取時間和液料比對蘆薈藥材中6個指標成分提取率的影響，結果顯示，50%甲醇水溶液75 mL超聲提取20 min為最佳。考察了乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液和甲醇-磷酸水等流動相體系。結果表明，當以甲醇-乙腈-0.3%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫時，各指標成分峰型對稱、分離度較好，運行時間短，效果最佳。比較了不同檢測波長(254、280、310、330、360 nm)下各色譜峰的峰形和分離度，結果顯示，254 nm處6個指標成分吸收強度高，基線平穩、分離度良好，故選擇254 nm為檢測波長。

表4 12批蘆薈樣品6個指標成分的含量

12批蘆薈藥材的指紋圖譜共識別23個共有峰，從相似度結果可知，除廣西產區的相似度低于0.5外，其他均大于0.93，說明市售的蘆薈藥材因產地不同，其化學成分種類和含量有很大差異。從聚類分析結果可知，12批蘆薈藥材聚為3類，與主成分分析結果一致。利用正交偏最小二乘判別法篩選出影響蘆薈藥材質量差異的5個色譜峰，并以相同HPLC法對其進行含量測定。因蘆薈大黃素也是蘆薈藥材中主要的生物活性化合物之一[21]，固也列入含量測定的指標性成分，其分析結果可知6個指標成分含量存在較大差異。這種差異可能是由于地理環境、氣候條件、采收期、土壤及田間管理、種植模式等諸多因素，對藥材次生代謝產物的積累產生影響，從而導致藥材相似度以及含量的差異性[22]；其次蘆薈藥材是以濃縮物的性狀呈現，其濃縮方式、烘干工藝、取材部位等也會使藥材的化學成分有很大差異。

本研究采用定量指紋圖譜結合化學模式多元判別方法對不同產地的蘆薈藥材成分差異進行分析，并對6個指標成分進行了含量測定，可直觀評價各產地蘆薈藥材品質的一致性，還同時體現化學成分的差異性，為蘆薈藥材的質量控制和后續相關產品開發提供科學參考。