人PBMC 中免疫蛋白酶體亞基LMP7 酶活力的檢測

成彥，凌春瑩，羅亞鴿，陳寶龍，孫瑞

河南省洛陽正骨醫院（河南省骨科醫院）生化研究室，河南洛陽 471000

免疫蛋白酶體是一種具有多相催化活性的蛋白酶復合體，它廣泛存在于血源性細胞，尤其是淋巴細胞和單核細胞中， 并直接參與了免疫系統的運作，在抗原呈遞、免疫應答等過程中扮演關鍵角色[1-4]。 免疫蛋白酶體亞基LMP7 在多種自身免疫性疾病中被認定為重要的自身抗原，針對它們的自身免疫反應可能與炎癥反應相關[5]。 免疫蛋白酶體促進Th 細胞分化，RA 細胞模型中，LMP7 受抑制可導致90% IL-23 的產生受抑制， 及 50% TNF-α 和 IL-6 受抑制； 抑制LMP7 活性，可緩解類風濕性關節炎小鼠模型病情[6]，提示LMP7 與RA 存在一定聯系，其表達、活性極有可能參與了RA 的發生、發展，但目前此方面研究較少。

迄今，有關人PBMC 中LMP7 酶活力的測定方法尚未見報道。 該研究擬在熒光法的基礎上，采用單因素實驗法對LMP7 活性測定條件進行優化， 確定人PBMC 中LMP7 酶活力測定的最優化條件， 以LMP7酶活力為依據，為進一步探究其在RA 發生、發展中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑

熒 光 多 肽 底 物 Ac-ANW-AMC、DMSO、Ficoll-Paque、無菌 PBS pH 7.2～7.4，其它試劑為分析純。

底物溶液配制： 熒光多肽底物Ac-ANW-AMC，底物原包裝2 mg，輕微離心，加入169.8 μL DMSO 制成20 mM 底物母液，分裝并儲存于-20℃。 使用時，用DMSO 稀釋為2 mM 工作液。

反應緩沖液：pH 8.0 Tris-HCl 50 mM，NaCl 150 mM，Glycerol 10%，SDS 0.01% (w/v)[11]。

1.2 儀器

多功能酶標儀（Spectramax i3x MD）；高速冷凍離心機 （5804R Eppendorf）； 分析天平 （XS205 METTLER-TOLEDO）；pH 儀（S220 METTLER-TOLEDO）；超純水儀（EASYPure II Barnstead）；超凈工作臺（SWCJ-1FD 蘇州安泰）。

1.3 實驗方法

1.3.1 PBMC 分離 依照單位倫理委員會批準的實驗方案。取健康受試者或RA 患者空腹外周靜脈血3 mL，肝素抗凝。超凈臺中進行細胞分離。3 mL 外周血加入等體積常溫 PBS（pH 7.2～7.4）緩沖液稀釋，15 mL 離心管事先加入3 mL Ficoll 淋巴細胞分離液， 傾斜離心管，緩慢小心地將混合均勻的PBS 和全血混合液加入分離液上層，20℃，400 g，快加速慢減速，離心 20 min；小心移出離心管，應可見4 層分離。上層血清，云霧層PBMC，中層 Ficoll， 下層為血漿。 使用 1 000 μL 移液槍，盡可能吸取云霧層，移入另一支15 mL 離心管，加入 10 mL 冷 PBS 充分洗滌，20℃，100 g，離心 10 min；棄上清， 輕彈試管， 加入10 mL 冷PBS 重懸細胞，20℃，100 g，離心 10 min，棄上清，加入 500 μl 反應緩沖液，重懸細胞，臺盼藍染色進行細胞計數。

1.3.2 細胞凍存及裂解 用反應緩沖液調整PBMC 細胞懸液濃度至 5×106個/mL，按每管 100 μl 細胞懸液進行分裝，置于液氮中冷凍。

1.3.3 LMP7 酶活力檢測 利用多肽熒光底物Ac-ANW-AMC， 通過檢測 37℃下，30 min 內多肽底物的水解速度，即熒光產物AMC 的產生速度Vmax，檢測免疫蛋白酶體亞基LMP7 的活性。

冷水浴解凍細胞懸液， 用冰反應緩沖液稀釋PBMC 細胞懸液至一定濃度，置于冰上待測。 在96 孔板的一個孔內加入99 μl 稀釋的PBMC 細胞懸液，加入 1 μl 稀釋的 Ac-ANW-AMC 底物液，37℃避光孵育10 min， 啟動反應。 Spectramax i3x 酶標儀設定為37℃，發射波長λex=360 nm，激發波長λem=460 nm，動力學方法檢測30 min，使用一級動力學方程描述熒光強度的變化值與時間之間的關系曲線[7]，記錄最大反應速度Vmax（單位U）及線性判定系數R2。

1.3..4 PBMC 細胞濃度（LMP7 酶濃度）優化

參照前期RA 患者PBMC 中LMP7 蛋白表達檢測結果，及已有LMP7 in vitro 活力檢測的相關報道[7]，選擇設定 PBMC 細胞濃度為 1 000 個/μl，500 個/μl，250 個/μl 以及 125 個/μL。 每個處理設置平行實驗 3次，包含健康受試者1 例，RA 患者2 例，每個實驗設3 次重復。

1.3.5 細胞凍融循環次數優化 免疫蛋白酶體極不穩定，其活性對機械方法及Triton 等化學試劑特別敏感[8]，凍融裂解可能是裂解的首選方法。將PBMC 細胞懸液在液氮中冷凍10 min 后，冷水浴中解凍細胞懸液，設為一個凍融循環。 為進一步優化裂解效果，將同一樣品分別進行1～5 次凍融后，檢測LMP7 酶活力。

1.3.6 細胞凍存時間對酶活力的影響 PBMC 在液氮中冷凍 10 min，3 h，1 d，3 d，7 d，14 d，21 d 及 28 d后，冷水浴解凍，檢測LMP7 活力。

1.4 統計方法

該次研究采用SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析，R2為紅性相關的判定系數。

2 結果

2.1 LMP7 酶濃度的優化

分別考察不同細胞濃度（酶濃度）下，Vmax 以及R2的變化， 檢測結果見表 1。 在 3 個樣本中， 不同PMBC 細胞濃度（酶濃度）組均表現出一定LMP7 酶活力，但不同樣本、不同PBMC 細胞濃度下，LMP7 酶活力差異較大。

圖1 PBMC 細胞濃度對LMP7 酶活力檢測的影響

3 個樣品中，酶活力與酶濃度（細胞濃度）均呈正相關。 其中健康受試者PBMC（樣品3）中LMP7 酶活力低于 RA 患者（樣品 1，樣品 2）。 樣品 1，樣品 2 中，當 PBMC 細胞濃度＞250 個/μl 時， 線性相關系數 R2＞0.95，見圖1（a），顯示該體系較好地符合一級反應動力學方程 Vmax=K3[E]，當 PBMC 細胞濃度為 125 個/μL時，R2＜0.95，與一級反應相關性較差，見圖 1（b）。健康受試者即樣品 3 中， 當 PBMC 細胞濃度≥500 個/μL時，線性相關系數R2＞0.95，顯示該體系較好地符合一級反應， 當 PBMC 細胞濃度為≤250 個/μL 時，R2＜0.95，與一級反應相關性較差。 為同時滿足對健康受試者及 RA 患者 PBMC 中 LMP7 酶活力的檢測，PBMC 細胞濃度應≥500 個/μL。

表1 PBMC 細胞濃度對LMP7 酶活力的影響

2.2 細胞凍融循環次數的優化

考察PBMC 細胞裂解時凍融循環次數對LMP7酶活力檢測結果的影響，見圖2。

結果表明，細胞冷凍循環次數對LMP7 酶活力檢測有較大影響。 一次凍融即可充分裂解細胞，滿足對PBMC 中 LMP7 酶活力的檢測。 當 PBMC 細胞裂解凍融循環為1～2 次時，LMP7 酶活力不受凍融循環次數影響，差異無統計學意義(P＞0.05)。隨著凍融循環次數的增加，LMP7 酶活力逐漸降低， 差異有統計學意義(P＜0.05)，凍融循環對LMP7 酶活力具有破壞作用，應盡量避免反復凍融。因此，在滿足實驗要求的前提下，為了進一步保護LMP7 酶活力及簡化實驗流程，選擇對PBMC 細胞進行一次凍融以達到裂解細胞的目的。

圖2 不同凍融循環次數下LMP7 的酶活力

2.3 PBMC 細胞凍存時間對LMP7 酶活力的影響

PBMC 細胞在液氮凍存不同時間之后的LMP7 酶活力，見圖3。 結果表明，在使用液氮凍存細胞10 min到21 d 內，LMP7 酶活力無顯著改變， 差異無統計學意義(P＞0.05)。 PBMC 細胞凍存 14 d 時，LMP7 酶活力較7 d 時略有下降，但差異無統計學意義(P=0.060)。 28 d時，LMP7 酶活力進一步減弱，較 1 d，3 d，7 d，14 d，21 d 均有差異有統計學意義(P＜0.05)。由此可見，使用液氮凍存PBMC 細胞， 可較好的保護LMP7 的酶活力，短時間凍存（＜21 d）對 LMP7 酶活力影響較小。 為確保實驗結果，應盡量縮短凍存時間（不超過21 d，7 d 內最佳）， 在PBMC 細胞提取、 冷凍后及時進行檢測。

圖3 PBMC 細胞凍存時間對LMP7 酶活力的影響

3 討論

酶活力指酶的催化活性，用規定反應條件下單位時間內底物的消耗量或產物的生成量來表示。當底物濃度遠遠大于酶濃度時，Vmax 與酶的濃度成正比。該研究利用多肽熒光底物Ac-ANW-AMC，采用動態法，連續檢測并計算單位時間內熒光產物AMC 的產生速度Vmax 來考察LMP7 酶活力。

饒文兵等通過極差分析得出酶濃度對酶活力測定的影響最顯著[9-10]。 Koroleva ON 等[7]得出 LMP7 酶活性 in vitro 測定的最優化條件為：37℃，pH 8.0 的Tris-HCl 50 mM，NaCl 150 mM，Glycerol 10% ，SDS 0.01% (w/v)緩沖液，酶濃度0.2 nM，底物濃度20 μM。根據前期 Western blotting 實驗， 每 106 個 PBMC 中LMP7（MW=27 kDa）含量約為 23～75 ng，該研究使用100 μlPBMC 細胞， 實驗濃度區間為 125～1 000 個/μl。研究結果顯示不同PBMC 細胞濃度即酶濃度下，LMP7 酶活力差異顯著， 無論是健康受試者還是RA患者，當 PBMC 細胞濃度達到 500 個/μl 以上時，線性判定系數R2均＞0.95，符合一級動力學方程Vmax=k3[E]，能夠更準確地反應酶活力。

Villoutreix BO 等[8]指出免疫蛋白酶體活性部位較不穩定，其活性受溫度、pH 及例如Triton-100 等化學物質影響， 即使-80℃低溫凍存其活性依然會隨時間降低。 根據分子克隆實驗指南[11]，該研究采用相對溫和的反復凍融法以釋放細胞中的蛋白質。使用液氮提高凍融速率，并在凍存時將PBMC 細胞懸液濃度提高為 5×106個/mL， 以盡可能地保護細胞及 LMP7 的酶活力。 為進一步優化裂解效果，對細胞冷凍保存時間和反復凍融法裂解對LMP7 酶活力的影響進行考察。研究結果表明經過3 次以上的凍融和21 d 以上的凍存對LMP7 酶活力的影響大，應在細胞提取后使用液氮凍融1 次后及時進行檢測。

泛素-蛋白酶體系統是一種高效、 特異的蛋白質降解系統，是真核細胞中非溶酶體通路蛋白質降解的主要途徑。 通過降解細胞內無用的、合成錯誤或受損的蛋白質來維持細胞內蛋白質的動態平衡，也因此參與調控生物體內幾乎所有生命活動：調節轉錄、細胞生長周期、細胞分化和凋亡、細胞應激反應等[3]。

蛋白酶體26S 中的3 種β 亞基具有蛋白水解活性：β1（酸后水解活性）、β2（類胰蛋白酶活性）和 β5(類糜蛋白酶活性)在血源性細胞，尤其是淋巴細胞和單核細胞中，蛋白酶體包含活性部位的3 個亞基分別被LMP2（β1i）、MECL1（β2i）和 LMP7（β5i）替代，組成免疫蛋白酶體，其底物特異性發生了變化。 免疫蛋白酶體亞基直接參與了抗體呈遞等免疫系統的運作，并在其中扮演關鍵角色[2-4]。

LMP7 在類風濕性關節炎等自身免疫性疾病的發生發展中發揮著重要作用[12]。 PR-957 是免疫蛋白酶體的共價性抑制劑，它選擇性地抑制免疫蛋白酶體亞基LMP7。 使用PR-957 處理RA 細胞模型可抑制IL-23、TNF-α 和 IL-6 等細胞因子的表達。 使用 PR-957 處理CAIA 類風濕性關節炎小鼠模型， 首次用藥24 h 后即可觀察到病情緩解，用藥7 d 后IL-1β、IL-6等炎性因子顯著降低，小鼠跗骨關節炎癥侵蝕和持續性的骨質溶解顯著降低[6]。揭示免疫蛋白酶體與RA 存在一定聯系，其表達、活性極有可能參與了RA 的發生、發展。該研究也證實，免疫蛋白酶體亞基LMP7 無論在健康人還是類風濕性關節炎患者的PBMC 中均有分布，且具有一定活性。RA 患者PBMC 中LMP7 活性高于健康受試者。通過大樣本量研究對比健康人與RA 患者PBMC 中LMP7 的表達及活性， 有助于進一步研究LMP7 在RA 發生發展中的作用及機制，為抑制免疫蛋白酶體治療自身免疫性疾病提供科學依據。

該研究發現樣本中健康受試者LMP7 活性遠遠低于RA 患者，提示LMP7 與RA 存在明顯相關性。但由于樣本量小， 不同個體樣本中LMP7 活性差異較大，為了得到準確的結論，仍需繼續進行大樣本采集檢測分析。

該研究確定了LMP7 酶活力檢測的最優條件，提供了一套簡便、實用、可靠的LMP7 酶活力檢測方法，對RA 等免疫性疾病中LMP7 酶的后續研究有重要意義。