堿性成纖維細胞生長因子凝膠緩解氯倍他索反復涂抹聯合膠帶剝離術導致的小鼠皮損

熊瓔珞 楊波 陳建文 薛琦 方海洲 張革

1中山大學藥學院微生物與生化藥學系（廣州510006）；2珠海億勝生物制藥有限公司研發中心（廣東珠海519085）；3中山大學藥學院（廣州510006）；4億勝生物科技（中國香港999077）

腎上腺皮質激素，發揮著抑制炎癥信號傳導的重要功能，被廣泛應用于慢性濕疹、銀屑病等疾病的治療［1］。臨床上長期接觸激素反而造成皮膚局部萎縮甚至皸裂等副作用［2］，但其具體機制仍有待闡明。FEINGOLD 研究組和李遠宏主任醫師分別通過在無毛小鼠上涂抹氯倍他索后行膠帶剝離操作和在豚鼠皮膚中反復涂抹丙酸氯倍他索，造成短期和長期接觸激素誘導的皮損和角化不全［3-4］，有效的模擬了臨床上激素長期接觸導致的皮膚局部損傷和功能失調的表型。目前激素依賴導致的皮損皮炎治療遵循戒斷激素、加強護理、綜合治療的原則來對患者進行臨床干預和觀察［5］。鈣調神經酶抑制劑他克莫司可通過抑制炎癥迅速緩解激素依賴性皮炎的干燥緊繃感［6］。聶元梅等用藍膚科寧護膚品治療激素依賴性皮炎發現治療后患者癥狀體征評分明顯低于治療前及對照組［7］。近年來越來越多的臨床研究關注生長因子類藥物在激素依賴性皮炎緩解中的療效［8］。

堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）可廣譜性的促進外胚層和中胚層來源的細胞的增殖、遷移和分化，具有促進組織修復、骨骼發育和維持代謝穩態等重要的生理作用［9］，已成為皮膚創傷、潰瘍和組織修復的重要候選藥物［10］。然而，bFGF 在長期激素接觸導致的皮損和皮炎副作用中的功能尚未被闡明，深入研究bFGF 在其中的修復作用和機制，具有強大的理論科研價值和應用前景。

本文在氯倍他索誘導的小鼠皮損模型上使用bFGF 凝膠干預，研究其對治療組小鼠表皮失水率和壞死、皮膚炎性浸潤的影響，且體外鑒定氯倍他索對人角質形成細胞的緊密連接蛋白表達的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑DMEM 培養基、胎牛血清（FBS）、0.25% 胰蛋白酶?EDTA 溶液（Gibco），100×青霉素?鏈霉素溶液、溴化噻唑藍四氮唑（MTT）、丙二醇溶液、5×蛋白上樣緩沖液、ECL 超敏化學發光試劑盒購自生工生物工程有限公司，RIPA 細胞裂解液（Thermo Fisher），anti?Claudin 1 抗體（Cell Signaling Technology），anti?Claudin 2 抗 體（Lifespan Biosci?ences），anti?GAPDH 抗體（Proteintech），丙酸氯倍他索（Sigma），bFGF 重組蛋白由珠海億勝生物制藥有限公司通過基因重組技術由大腸桿菌發酵后獲得，與卡波姆、甘油和羥苯乙酯輔料一起制備為凝膠。

1.2 實驗動物飼養及造模SPF 級6 ～8 周齡的C57BL/6J 雌鼠購自廣東省實驗動物中心，飼養于中山大學實驗動物中心SPF 級屏障環境動物房內，給藥及造模均于屏障內進行。將小鼠背部剃毛暴露2 cm × 2 cm 面積的皮膚，按7 只每組分為3 組：一組為溶媒對照涂抹溶解氯倍他索的試劑丙二醇∶乙醇7∶3（體積比）；一組為造模組涂抹0.05%的氯倍他索溶液，每天給藥2 次，持續7 d；一組為造模并給予bFGF 外用凝膠干預組，在每次涂抹完氯倍他索溶液30 min 后，涂抹含bFGF 20 μg/g gel 的外用凝膠（同時前兩組涂抹同樣體積的空輔凝膠，即包含卡波姆、甘油和羥苯乙酯的凝膠）。最后一次給藥后24 h，使用無菌敷貼在給藥部位進行膠帶剝離操作4 次，并在膠帶剝離完成時和12 h 后拍照記錄背部皮膚外觀。

1.3 小鼠表皮水分流失測定在膠帶剝離術后12 h 固定小鼠，將手持VapoMeter 皮膚水分測定儀緊貼于小鼠背部皮膚，讀取經表皮水分流失（trans epidermal water loss，TEWL）讀數，連續測量兩次，取平均值。

1.4 小鼠皮膚組織H&E 染色及病理分析皮膚組織經多聚甲醛固定后進行石蠟包埋切片，按文獻中方法行H&E 染色［11］。在ZEISS Axiocam ERc 5s 高倍（200 ×）光學顯微鏡下行切片拍照，并分析組織內表皮脫落和組織炎性浸潤情況。認定核質固縮的細胞為死細胞，鑒定多型分裂核、胞質淺染的細胞為中性粒細胞，同時對具有明顯血管腔壁和紅細胞的血管進行多視野計數。

1.5 人角質形成細胞系HaCaT的體外培養永生化的人角質形成細胞系HaCaT 購于中國科學院上海生物與化學研究所，將HaCaT重懸于含有10%FBS和1% 青霉素?鏈霉素溶液的DMEM 培養液中，置于37 ℃、5% CO2環境中進行培養，24 h 后細胞呈貼壁狀態。每隔2 天換一次液，待細胞生長到融合度90%以上時，用0.25%的胰蛋白酶?EDTA 溶液消化后，按1∶5 的比例進行傳代，約3 ～4 d 傳代一次，取第3 ～7 代細胞開展后續實驗。

1.6 氯倍他索體外刺激后細胞活力及緊密連接蛋白檢測將HaCaT 按1 × 104/孔的密度接種于96孔板中，培養過夜至貼壁狀態后，更換含0.2%FBS的條件培養液，血清饑餓過夜。向培養體系中加入氯倍他索溶液至工作濃度分別為20、40、60、80 μg/mL（對照組給予等體積的DMSO），將孔板置于37 ℃、5% CO2環境中培養72 h。然后向培養體系中加入MTT 溶液至終濃度為5 mg/mL，繼續孵育4 h 后棄去培養液，向孔板中加入DMSO：無水乙醇體積比1∶1 配置的細胞裂解液（120 μL/孔），振蕩10 min 后于Molecular Devices 多功能酶標儀上記錄570 nm 和630 nm 處的吸光值，計算給藥組相對對照組的細胞活力（%）?；驅aCaT 按2×105/孔的密度接種于12 孔板中，培養和給藥方法一致，氯倍他索刺激24 h 后使用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，通過Western blotting 方法［12］檢測緊密連接蛋白Claudin 1，Claudin 2 的表達水平。

1.7 統計學方法所有實驗數據均在GraphPad Prism 5 軟件中進行統計學分析，連續數據以形式表示，采用One?way ANOVA 方法統計數據，以P＜0.05 為差異有統計意義。

2 結果

2.1 bFGF 凝膠干預顯著減緩氯倍他索涂抹聯合膠帶剝離造成的小鼠背部皮損處死小鼠前拍照記錄小鼠背部皮膚外觀可發現，造模組的小鼠皮膚在膠帶剝離完成時和12 h 后均存在嚴重皮損，表現為表皮發紅、水腫且存在明顯外傷未愈合（圖1B，1D），而涂抹溶媒的對照組小鼠皮膚只在膠帶剝離剛完成時可見表皮輕微紅腫，12 h 后基本恢復正常（圖1A，1C）。給予了bFGF 外用凝膠的小鼠在膠帶剝離完成時皮膚紅腫程度顯著弱于單獨氯倍他索造模的小鼠（圖1B，1C），12 h 后皮損面積也明顯減?。▓D1E，1F）。

圖1 膠帶剝離完成時與膠帶剝離操作12 h 后小鼠背部皮膚照片Fig.1 Back photos of mice just after tape?stripping and 12 hours post tape?stripping

2.2 bFGF凝膠干預顯著降低氯倍他索反復涂抹聯合膠帶剝離增加的表皮失水率膠帶剝離完成12 h后檢測小鼠背部表皮水分流失，發現給予了氯倍他索的造模組小鼠表皮失水率（38.83 ± 1.85 g/m2h）顯著高于溶媒對照小鼠（16.93±0.79 g/m2h），而涂抹了bFGF 凝膠后小鼠背部表皮失水率（31.12 ±1.77 g/m2h）明顯降低（表1），但仍高于溶媒對照組（圖2）。

2.3 bFGF凝膠干預顯著減少造模組表皮細胞壞死和皮膚炎性浸潤小鼠皮膚組織H&E 染色顯示，溶媒對照組表皮層結構完整，鱗狀上皮細胞形態正常、排列緊密；真皮層膠原纖維豐富、排列規則（圖3A）。造模組可見大量表皮層細胞核固縮，胞質嗜酸性增強，細胞體積減小（黑色箭頭），大面積真皮層細胞壞死，核碎裂（黃色箭頭），伴有較多中性粒細胞浸潤（藍色箭頭、圖3B）。涂抹bFGF 凝膠干預后小鼠的表皮層細胞核固縮和真皮層細胞壞死狀況得到明顯改善，同時中性粒細胞的浸潤減少（圖3C）。

表1 膠帶剝離12 h 后小鼠表皮失水率測定Tab.1 Detection of trans epidermal water loss at 12 hours post tape?stripping

圖2 膠帶剝離12 h 后小鼠表皮失水率測定Fig.2 Detection of trans?epidermal water loss at 12 hours post tape?stripping

2.4 bFGF 凝膠干預改善造模組皮下組織出血小鼠皮膚組織H&E 染色顯示，氯倍他索造模組小鼠皮下組織局部可見輕度出血和血管數目增加（圖3 B 紅色箭頭），高倍鏡視野下進行血管計數發現造模發生皮損后小鼠皮下組織血管生成數目相比溶媒組小鼠急劇增多，而bFGF 凝膠干預組小鼠血管數目明顯減少（圖4）。

3 討論

本研究中的激素涂抹聯合膠帶剝離改良造模方法可造成小鼠皮膚損傷，此表型有效的模擬了臨床上激素依賴導致的皮損和皮炎副作用。而給予bFGF 凝膠干預可有效減弱皮損，表現為表皮失水率的減少，表皮層細胞大量壞死和出血情況的改善。本研究采樣時間點檢測到造模組皮損程度和表皮失水率仍顯著高于溶媒組，但bFGF 凝膠干預組外傷已基本愈合，提示bFGF 加速了表皮組織屏障功能的修復。在FEINGOLD［13］的研究中，單獨膠帶剝離實驗可誘導IL?1α，IL?1β，IL?6，TNF?α，GM?CSF 等炎癥因子表達的上調，同時伴隨中性粒細胞向組織局部聚集。此外，持續的bFGF 刺激可以下調炎癥因子IL?1 或TNF?α誘導的中性粒細胞內皮粘附和經內皮遷移［14］。本研究中使用bFGF干預凝膠檢測到皮損局部中性粒細胞炎性浸潤較單獨使用激素組明顯降低，提示皮膚損傷恢復期bFGF 可介導局部炎癥應答減弱，該內容需要進一步體內外實驗進行驗證。

圖3 各組小鼠皮膚組織H&E 染色（200×）Fig.3 H&E staining of skin tissue of mice in each group（200×）

圖4 高倍鏡（200×）下小鼠皮下組織血管計數Fig.4 Vascular counting in mouse subcutaneous tissue in high magnification（200×）

此外，本研究發現bFGF 凝膠干預后小鼠皮膚的出血情況得到改善，真皮組織和皮下組織區血管數目顯著減少。隨著bFGF 對于新生血管作用研究的加深，bFGF 已從一種簡單的促血管生成細胞因子［15］，逐漸被發現為在微環境中參與血管重塑的因子［16］，持續的bFGF 釋放還可能通過抑制內皮的活化和免疫細胞的募集從而調控炎癥［14］。本文誘導的皮損模型中發現，血管數目的增加與組織損傷和炎癥反應程度呈正相關，而與bFGF 凝膠無直接關聯。

圖5 不同濃度氯倍他索刺激的人角質形成細胞HaCaT 細胞活力測定和緊密連接蛋白水平測定（200×）Fig.5 Determination of HaCaT cell viability and tight junction protein in human keratinocytes stimulated by different concentrations of clobetasol（200×）

長期接觸氯倍他索會造成皮膚局部萎縮甚至皸裂等副作用［17］，但其中的細胞分子機制尚不明確。VIENNET 組鑒定了不同種類和濃度的腎上腺皮質激素對人角質形成細胞HaCaT 的增殖抑制作用［18］，FEINGOLD 發現［3］短期反復涂抹氯倍他索的小鼠皮膚角質層細胞間脂質前體合成顯著減少，從而使表皮通透性增強。而Claudin 蛋白作為主要表達于表皮層中的重要的緊密連接蛋白家族，形成細胞間的緊密連接并調節各類小分子的跨表皮內外滲透［19］，因此檢測其在激素接觸條件下的細胞和組織水平，對鑒定表皮的通透性具有重要指示意義。本實驗驗證了氯倍他索對HaCaT細胞增殖的抑制作用，同時開創性的通過免疫印跡法鑒定發現氯倍他索下調Claudin 1 和Claudin 2蛋白的表達（圖5），對后續研究氯倍他索等糖皮質激素造成的皮膚不良反應研究提供了新的思路。

總之，bFGF 凝膠有效的保護和緩解了激素反復接觸聯合機械外力造成的實驗性小鼠皮損，為以外源性bFGF 為活性成分的藥物應用于臨床上激素依賴性皮損皮炎的治療提供了一定的理論支撐和研發思路。