血小板活化對腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成影響的實驗研究

翟金海 張佳怡 徐速

1江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院（江蘇鹽城224008）；2南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（南京210001）；3南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬鹽城市中醫(yī)院（江蘇鹽城224001）

克羅恩病（crohn disease，CD）是一種慢性非特異性肉芽腫性炎癥［1］，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，通常被認(rèn)為與免疫因素有關(guān)，是消化科常見難治性疾病之一。由于腸壁的慢性炎癥反復(fù)刺激，形成了整個腸纖維化層，導(dǎo)致腸道狹窄甚至梗阻。CD導(dǎo)致的腸腔狹窄等嚴(yán)重并發(fā)癥［2］，常需手術(shù)治療。CD 活動期患者外周血小板的異常增高與活化，常與活動程度相關(guān)性較高，可作為疾病活動度的一個評估指標(biāo)［3］。近幾年國內(nèi)外對腸纖維化的發(fā)病機(jī)制有較多研究進(jìn)展，其中血管生成被認(rèn)為是其中十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)［4］，但目前還沒有從干預(yù)血管生成的角度來改善腸纖維化的研究。本實驗通過觀察比較加入PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 前后，IMECs 細(xì)胞遷移、管腔形成能力的變化來研究活化的血小板對IMECs 血管生成的影響。觀察對PI3K/AKT/mTOR 信號通路磷酸化相關(guān)蛋白及HIF?1α的蛋白表達(dá)的影響，以及對纖維化相關(guān)因子E?cadherin、α?SMA、CollagenI 蛋白表達(dá)變化和基因表達(dá)水平的影響，探討血小板活化誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞的EMT 的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細(xì)胞大鼠IMECs 細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液和胰蛋白酶EDTA（美國GIBCO 公司），胎牛血清（Biologi?cal Industries，批號：1418110），Penicillin G Sodium Salt（AMRESCO公司Cat.No.2010242），Streptomycin Sulfate（AMRESCO 公司Cat.No.2010382），NaHCO3（美國Gibco 公司Cat.No.11810?033），Trypsin（AM?RESCO公司Cat.No.2010/04），Trizol（美國Invitrogen公司Cat No.15596?026），SDS：santacruze公司（Cat No.sc?264510），PVDF 轉(zhuǎn)移膜（DOCLAB 公司Cat No.16220405），anti E?cadherin（美國Bioworld 公司），Antiα?SMA（Cell Signaling，美國；編號19245），anti Collagen I（美國abcam；編號AB90395），anti PI3K，anti p?PI3K（Sigma 公司，美國），antiAkt（武漢Protec?tech；編號60203?2），anti?pAkt（美國Cell Signaling；編號4060），antimTOR（美國AbCam；編號AB32028），anti?HIF?1α，anti?GAPDH，antip?mTOR（美國AbCam公司），antiGapdh（武漢Protectech；編號10494?1），BEZ235 抑制劑（Selleck 美國CAS915019?65?7），Matrigel 膠（Affinity 美國），逆轉(zhuǎn)錄及PCR 反應(yīng)體系購自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 IMECs 分離、培養(yǎng)在無菌條件下取健康大鼠部分空腸剪碎，加入消化液（37 ℃，0.25%胰蛋白酶）1 mL，在0.25%胰酶1 mL 滅菌離心管中消化5 min，用15%FBS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基5 mL 終止消化。4 ℃、3 000 r/min 離心8 min，棄上清，加完全培養(yǎng)基（15% FCS?F12、0.5 μg/mL 胰島素、1 μg/mL 氫化可的松、5 μg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白、2 μmol/mL 谷氨酰胺）；得到的懸液在4 ℃條件下，再離心8 min 后，吸除上清液，加入8 mL 完全培養(yǎng)基，輕輕吹打數(shù)次后，靜置1 min，吸取懸液，轉(zhuǎn)入0.1%明膠包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)96 h 后局部的消化處理和培養(yǎng)72 h 后的差速黏附處理，得到純化內(nèi)皮細(xì)胞。經(jīng)上述處理的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長傳代，取第三或四代用于實驗。

1.2.2 鼠富PLT血漿（PRP）和洗滌血小板（washed platelet，WP）制備及血小板的活化的檢測以上各組大鼠在麻醉處死前，腹主動脈取血。WP 制備：將抗凝管中的全血輕輕混勻，室溫下離心，800 r/min 離心15 min，取上層PRP 再次室溫下離心，2 000 r/min 離心10 min，加入1 μmol/L 的前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）防止血小板活化，棄上層血漿，以PBS 緩沖液洗滌PLT 兩次，重新輕輕重懸于PBS 緩沖液或培養(yǎng)基中，制成血小板混合懸液，同時調(diào)整PLT 計數(shù)為2×108/mL［5］。

1.2.3 IMECs細(xì)胞的Transwell遷移實驗24孔板的Transwell 小室（8 μmol/L 聚碳酸脂膜），上室膜表面均勻鋪被去生長因子的Matrigel 的DMEM 培養(yǎng)基稀釋液（1∶4，v/v）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置30 min 使之凝固，備用。取對數(shù)生長期的IMECs細(xì)胞懸液100 μL 接種于上室，低血清培養(yǎng)（0.5%，v/v），下室加入無血清DMEM培養(yǎng)基600 μL。每組均設(shè)3 個復(fù)孔。根據(jù)分組情況，加入活化血小板、PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 作用于IMECs 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后取出小室，棄去培養(yǎng)基，漂洗2 次，用鑷子取下濾膜置于載玻片上，于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5 個視野，觀察并計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目。

1.2.4 毛細(xì)血管管腔形成實驗將基質(zhì)膠Matrigel（100 μL/ 孔）加入48 孔培養(yǎng)板實驗孔，37 ℃培養(yǎng)箱 內(nèi) 溫 育30 min 凝 固 后，每 孔 加 入1 × 105個IMECs 細(xì)胞，細(xì)胞中分別加入活化血小板及PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235，共孵育12 h，對毛細(xì)血管管腔形成使用倒置顯微鏡觀察和拍照，并以Image J軟件對管腔形成長度進(jìn)行定量分析。每組設(shè)三個復(fù)孔，每孔選5 個視野，實驗重復(fù)3 次。

1.2.5 Western blot 法檢測IMECs 細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/mTOR 信號通路蛋白表達(dá)刺激細(xì)胞作用結(jié)束時，加苯甲基磺酰氟（PMSF）+放射免疫沉淀試驗（RIPA）細(xì)胞裂解液，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，上清液中的蛋白濃度以二喹啉甲酸（BCA）法測定。取等量蛋白與5×上樣緩沖液混合煮沸5 min 后上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺（SDS?PAGE）凝膠電泳。電泳后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用含5%脫脂奶粉和TBST 緩沖液（20 mmol/L Tris HCl，150 mmol/L NaCl 和0.05%Tween 20）封閉1 h，加入一抗E?cadherin（1∶5 000）定影。同法測定各組細(xì)胞中α?SMA、CollagenI 蛋白含量。

1.2.6 RT?PCR 法檢測IMECs 纖維化相關(guān)基因mRNA 水平的影響（1）提取細(xì)胞總RNA；（2）反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 ℃15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），95 ℃2 min（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）；（3）PCR 反應(yīng)：預(yù)變性：95 ℃10 s；PCR反應(yīng)：變性95 ℃5 s，退火/延伸60 ℃，30 s，共40 個循環(huán)。每個樣本均做GAPDH 管作為內(nèi)標(biāo)。各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行RT? PCR 反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品梯度的測量結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計算各樣品所測基因含量，各樣品目的基因的含量除以其管家基因的含量，即得到樣品校正后的基因相對含量。E?cadherin 引物序列：上游5′?GCCAATCCTGATGAAATTGGAA?3′，下游5′?CAGAACCACTGCCCTCGTAATC?3′；α?SMA 引物序列：上游5′?ATAACATCAAGCCCAAATCTGC?3′，下游5′?TTCCTTTTTTCTTTCCCAACA?3′；colllagenⅠ引物序列：上游5′?TACAGCACGCTTGTGGATG?3′，下游5′?TTGGGATGGAGGGAGTTTA?3′；GAPDH 引物序列：上游5′?GAAGGTGAAGGTCGGAGTC?3′，下游5′?GAAGATGGTGATGGGATTTC?3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。各實驗獨立重復(fù)≥3 次，計量資料以（）表示，兩組間比較采用配對t?test，多組間比較采用Oneway?ANOVA。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IMECs 鑒定經(jīng)倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)特征鑒定95%以上為內(nèi)皮細(xì)胞特征，呈短梭形和多角形；免疫組織化學(xué)染色CD31 蛋白抗原陽性（圖1）。

圖1 IMECs 內(nèi)皮細(xì)胞鑒定CD31 蛋白抗原檢測（×400）Fig.1 CD31 protein antigen detection for IMECs endothelial cell identification（×400）

2.2 流式法檢測靜息及活化的血小板P?selectin抗體濃度加入終濃度為25 μmol/L 的血小板激動劑二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）到上述血小板中［6］，溫箱中放置20 min 即為活化血小板。為了檢測血小板活化程度，以流式法分別檢測上述靜息及活化的血小板P?selectin 抗體濃度。血小板活化采用P?selectin 活化指標(biāo)檢測其含量［模型組：ADP 誘導(dǎo)（25 μmol/L）］，結(jié)果顯示，加入ADP 后P?selectin 抗體濃度明顯增高（P＜0.01），表明活化血小板數(shù)量明顯增加（圖2）。

圖2 流式法檢測靜息及活化的血小板P?selectin抗體濃度Fig.2 Flow cytometry for detection of resting and activated platelet P?Selectin antibody concentrations

2.3 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對血小板活化誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞遷移能力的影響Platelets 誘導(dǎo)組細(xì)胞遷移數(shù)明顯增加，而抑制劑處理組能顯著抑制platelets 誘導(dǎo)所致的細(xì)胞遷移的增加（P＜0.01，圖3）。

2.4 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對血小板活化誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞管腔形成的影響Platelets 誘導(dǎo)組細(xì)胞小管形成能力明顯增強(qiáng)，而抑制劑處理組能顯著抑制platelets 誘導(dǎo)所致的管腔形成（P＜0.01，圖4）。

2.5 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235對血小板活化誘導(dǎo)的IMECs通路蛋白磷酸化及HIF?1α的影響應(yīng)用PI3K 抑制劑BEZ 處理后，再用活化的血小板上清誘導(dǎo)，PI3K/AKT/mTOR 蛋白無明顯變化（P＜0.05），而相關(guān)蛋白磷酸化水平明顯受到抑制，HIF?1α受抑制（P＜0.01，圖5）。

2.6 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對血小板活化誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞的EMT 影響抑制劑BEZ235處理后，纖維化相關(guān)蛋白α?SMA、Collagen I 明顯受到抑制（P＜0.01），而E?cadherin 表達(dá)上調(diào)（P＜0.01，圖6）。

圖3 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對血小板誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞遷移能力的影響（結(jié)晶紫染色×200）Fig.3 Effects of PI3K/mTOR inhibitor BEZ235 on platelet?induced IMECs cell migration（crystal violet staining× 200）

圖4 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對血小板誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞管腔形成的影響（×200）Fig.4 Effects of PI3K/mTOR inhibitor BEZ235 on platelet induced lumen formation of IMECs cells（×200）

圖5 加入BEZ235 后對通路蛋白磷酸化及HIF?1α的影響Fig.5 Effects of BEZ235 on phosphorylation of pathway proteins and HIF?1α

2.7 PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235 對血小板活化誘導(dǎo)的IMECs 細(xì)胞EMT 相關(guān)基因表達(dá)的影響B(tài)EZ235 處理后，加入platelets 誘導(dǎo)，RT?PCR 檢測纖維化指標(biāo)，結(jié)果如圖7 所示：platelets 誘導(dǎo)組纖維化相關(guān)基因（α?SMA，collagenⅠ）表達(dá)增加，而抑制劑處理組能顯著抑制platelets 誘導(dǎo)所致的纖維化基因表達(dá)的增加。同時E?cadherin 基因表達(dá)相反，模型組顯著降低，抑制劑處理后明顯增加。

圖6 加入BEZ235 后對細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白的影響Fig.6 Effects of BEZ235 on EMT?related proteins in cells

3 討論

在本研究中，通過IMECs 細(xì)胞實驗，在CD 細(xì)胞模型中研究了IMECs 細(xì)胞的EMT 機(jī)制。正常人體內(nèi)血小板功能處于靜息狀態(tài)，而CD 患者腸道黏膜活檢可見毛細(xì)血管內(nèi)血小板的聚集，CD 患者活動期時腸道免疫紊亂引起白細(xì)胞在局部腸粘膜組織的聚集，腸道局部及血漿中不同炎性因子的改變，通過破壞內(nèi)皮屏障功能，增加局部血管通透性，腸道微血管內(nèi)皮細(xì)胞的受到損傷，基底膜膠原蛋白暴露，刺激了血小板生成及活化，血小板在受損血管的聚集、粘附，使腸道微血管栓塞，導(dǎo)致缺血性損傷壞死；同時體內(nèi)血小板的聚集性增加，血液中纖維蛋白增多，粘滯性增高，患者體內(nèi)呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，微血栓形成，繼而腸道血流灌注量減少，腸黏膜細(xì)胞因缺血缺氧而變性，引起黏膜組織損傷，引發(fā)或加重炎癥、潰瘍、血管新生、纖維化修復(fù)等多種病理過程［7］。有研究表明，在炎癥性腸病發(fā)病過程中，血小板增多和活化能參與炎癥的起始過程，進(jìn)一步激活血管生成，與血栓、纖維化等形成相關(guān)［8］。血小板活化與CD 的腸纖維化聯(lián)系密切在臨床已經(jīng)得到證實，但其中現(xiàn)代醫(yī)學(xué)機(jī)理的闡明，尚待研究。

圖7 加入BEZ235 后對細(xì)胞EMT 相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of BEZ235 on the expression of EMT?related genes in cells

隨著血小板和血管生成研究的不斷深入，血小板在血管生成過程中的作用也逐漸得到了肯定。PINEDO 等［9］首先提出了血小板參與血管生成的證據(jù)，認(rèn)為血小板的活化與血管生成關(guān)系密切。在微血管生成的過程中，血小板可以釋放多種血管形成促進(jìn)因子如VEGF、血小板衍生生長因子（platelet?derived growth factor，PDGF）等（最主要是VEGF），經(jīng)旁分泌作用于內(nèi)皮細(xì)胞，從而啟動并促進(jìn)血管生成過程，在血管生成早期階段的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］；在體外實驗中，血小板能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管的管腔形成［11］。VEGF 受體中的VEGFR?2 直接參與血管生成，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生長和滲透；VEGF 家族中的VEGF?A 與VEGFR?2 結(jié)合是控制血管生成的關(guān)鍵途徑［12］。二者結(jié)合引起受體二聚化，從而激活下游包括PI3K/AKT/mTOR 在內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，共同支持內(nèi)皮細(xì)胞的生存和刺激其增殖，從而促進(jìn)血管生成，是VEGF 引起內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的主要信號通路［13］。PI3K/AKT 信號通路廣泛參與細(xì)胞生理活動，在維持細(xì)胞的正常生理功能，如細(xì)胞生長、分化、代謝等方面起著關(guān)鍵作用；mTOR 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是調(diào)控細(xì)胞生長與增殖的關(guān)鍵通路，對細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、代謝、血管新生以及細(xì)胞周期等進(jìn)行調(diào)控；前期血小板相關(guān)實驗亦證實血小板活化釋放多種促血管生成因子作用于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）發(fā)生血管生成［14］。目前，血小板活化對腸纖維化作用的機(jī)制尚不明確，而病理性血管生成為闡明該機(jī)理提供了一個新的視角，對以病理性血管生成及血小板活化為靶標(biāo)的抗腸纖維化治療的探索至關(guān)重要。

纖維化的病理過程包括炎癥、缺氧、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等復(fù)雜過程［15］。研究顯示：CD 腸道病變的早期炎癥是纖維化過程的一個關(guān)鍵觸發(fā)因素，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積為纖維化進(jìn)程的特征。EMT 在啟動和維持腸纖維化中有重要作用［16］，EMT 作為生物體內(nèi)的一種生理病理現(xiàn)象，除了參與胚胎形成、發(fā)育及新生血管形成外，也參與體內(nèi)纖維化紊亂等過程。因此，對腸血管內(nèi)皮細(xì)胞的EMT 機(jī)制研究，也是研究腸纖維化的重要方向。在EMT 過程中，內(nèi)皮細(xì)胞不僅表型發(fā)生明顯變化，相關(guān)標(biāo)記物也同樣發(fā)生了變化：內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，如E?cadherin 表達(dá)量下降；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，如α?SMA 等表達(dá)上調(diào)。此外，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖能力明顯增強(qiáng)。

過度和異常的血管生成作為組織異常修復(fù)的中心環(huán)節(jié)越來越多地引起關(guān)注。缺氧是導(dǎo)致血管生成的最主要刺激因素，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)核心轉(zhuǎn)錄因子HIF?lα。幾乎所有的促血管生成因子的表達(dá)都是由HIF?lα的轉(zhuǎn)錄活性改變而受到調(diào)控，如VEGF、PDGF 等，這些因子參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控血管生成過程［17］；而缺氧亦為導(dǎo)致器官纖維化的機(jī)制之一，HIF?lα誘導(dǎo)的EMT 通過一定的途徑調(diào)控器官纖維化的形成和發(fā)展［18］，如HIF?lα能夠通過Snail 和β?catenin 信號通路調(diào)控endoEMT 從而干預(yù)早期肺纖維化的進(jìn)程［19］。PI3K/AKT/mTOR 信號通路，被認(rèn)為是HIF?lα主要的上游調(diào)節(jié)通路之一［20］，而從上文可以看出其亦為VEGF 介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的主要通路。HIF?lα為從血管生成到纖維化進(jìn)程中的關(guān)鍵樞紐性因子，而PI3K/AKT/mTOR通路為從血小板活化到血管生成最終形成纖維化這一進(jìn)程中的關(guān)鍵信號通路。

最近的研究發(fā)現(xiàn)血管生成與纖維化密切相關(guān)［21-23］。VEGF 的高表達(dá)在血管生成發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［24-26］。在本研究中，發(fā)現(xiàn)足量的活化的血小板可以刺激IMECs 的血管生成。此外，本研究還初步闡釋了相關(guān)的作用機(jī)制和信號通路。本研究評價了VEGF 的相對蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)VEGFR組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示VEGF 與VEGFR 表達(dá)無相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示加入PI3K/mTOR 抑制劑BEZ235前后比較，活化的血小板刺激增強(qiáng)了IMECs的細(xì)胞遷移能力、管腔形成的能力，對PI3K、AKT、mTOR 磷酸化蛋白及HIF?1α蛋白起到抑制作用，纖維化相關(guān)因子α?SMA、Collagen I 的蛋白生成及基因表達(dá)明顯受到抑制，而E?cadherin 蛋白生成及基因表達(dá)則上調(diào)。表明活化血小板誘導(dǎo)的IMECs細(xì)胞的EMT 是通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路影響血管生成實現(xiàn)的。