鐵死亡參與高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化及ox?LDL誘導的泡沫細胞形成過程

劉洋 孫岳 楊安寧 劉子歌 劉太陽 郝瑋 劉耀陽 王秋實 劉志宏

寧夏醫科大學1公共衛生與管理學院，2基礎醫學院，3臨床醫學院（銀川750004）；4國家衛生健康委代謝性心血管疾病研究重點實驗室（銀川750004）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種脂質驅動的動脈內膜炎癥性疾病，是多種心血管疾病的病理基礎［1］。鐵死亡是一種鐵依賴的氧化性細胞死亡，其特征是細胞內鐵的增加和抗氧化能力的降低導致過氧化脂質的致死性積累［2］，鐵死亡已被證明對多種疾病具有重要意義。脂質過氧化、斑塊內出血和鐵沉積是晚期人類AS 斑塊的特征［3］，這是AS 中鐵死亡發生的間接證據。已有研究證實［4］抑制鐵死亡可以減輕小鼠主動脈內皮細胞的脂質過氧化和AS。動脈內膜中巨噬細胞源性泡沫細胞的形成是早期AS 病變的主要標志，且在AS 發生發展的各個階段都起著重要作用，但鐵死亡在泡沫細胞及AS 形成中的作用尚不清楚。因此，本文擬從泡沫細胞鐵死亡角度出發，探討ox?LDL 誘導巨噬細胞泡沫化以及高脂飲食誘導ApoE-/-小鼠AS 過程中是否有鐵死亡發生，并討論了泡沫細胞鐵死亡在晚期斑塊中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動脈粥樣硬化動物模型制備本次研究選用6 ～8 周齡雄性ApoE-/-小鼠，購于寧夏醫科大學動物中心。12只ApoE-/-小鼠隨機分為兩組（n=6）：（1）對照組：普通飼料喂養；（2）模型組：高脂飼料（1.25%膽固醇）喂養。飼養于寧夏醫科大學SPF級實驗動物中心，小鼠飼養16 周后處死，進行后續實驗。整個實驗過程符合寧夏醫科大學實驗動物使用倫理規定。

1.1.2 正常RAW264.7 巨噬細胞的培養及泡沫細胞模型的復制RAW 264.7巨噬細胞購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，細胞使用完全培養基（10%胎牛血清+DMEM 高糖培養基+1%雙抗）培養于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱，將處于對數生長期的RAW264.7 巨噬細胞隨機分為Control 組和Ox?LDL 組，Control 組給予常規培養基，Ox?LDL 組給予含有50 mg/L ox?LDL 的培養基誘導培養24 h，即為RAW264.7 巨噬細胞源性泡沫細胞模型［5］。

1.1.3 實驗試劑和儀器設備H&E 染色試劑盒（碧云天，中國）；油紅O 檢測試劑盒（索萊寶，北京）；RNA 提取試劑盒（天根，中國）；反轉錄和熒光定量PCR 試劑盒（賽默飛，美國）；熒光定量PCR 儀（楓嶺國際，上海）；谷胱甘肽檢測試劑盒（南京建成，中國）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（貝博，中國）；鐵離子比色法檢測試劑盒（普利萊，北京）；蛋白提取試劑盒（凱基，南京）；p53、GPX4 和SLC7A11抗體（abcam，美國）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（博奧森，北京）；DMEM 培養基和胎牛血清（Gibco，美國）；電泳儀及凝膠成像系統（Rio?Rad，美國）。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平檢測全自動生化分析儀檢測小鼠血清中TG、TC、LDL?C 和HDL?C 的含量。

1.2.2 H&E 和油紅O 染色觀察小鼠主動脈根部斑塊面積大小和脂質沉積H&E 染色：多聚甲醛固定冰凍切片，流水清洗后蘇木素染色，1%鹽酸乙醇分化后流水沖洗返藍，隨后伊紅染色，梯度脫水透明后封片，光鏡下觀察。

油紅O 染色：多聚甲醛固定冰凍切片，60%異丙醇浸洗，油紅O 染色，蘇木素復染，流水沖洗返藍，1%鹽酸乙醇分化，封片后在光鏡下觀察。

1.2.3 qRT?PCR 檢測泡沫細胞及主動脈組織中p53、GPX4 和SLC7A11 mRNA 表達水平取主動脈組織或細胞，按照試劑盒說明書提取總RNA，測定濃度后進行反轉錄，加入擴增反應體系運用qRT?PCR 法擴增。本次引物由上海生物工程公司合成，引物序列見表1。采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence table

1.2.4 Western blot 法測定泡沫細胞及主動脈組織p53、GPX4 和SLC7A11 蛋白表達水平取主動脈組織或細胞，使用蛋白提取試劑盒提取蛋白。制備蛋白樣品后進行SDS?PAGE 電泳，采用濕轉法轉印至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后一抗4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育2 h，加入ECL 發光底物顯色后，使用凝膠成像儀成像。以目的蛋白與β?actin 蛋白光密度的比值反映目的蛋白的相對表達水平。

1.2.5 泡沫細胞中ROS、GSH、MDA 和Fe2+水平的檢測熒光探針DCFH?DA 檢測各組細胞內過氧化標志物ROS 水平，比色法觀察各組細胞內GSH、MDA 和Fe2+水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學方法采用SPSS 23.0軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高脂飲食誘導ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型的建立血脂膽固醇水平檢測結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL?C 水平顯著升高（P＜0.01），HDL?C 差異無統計學意義（P＞0.05，圖1）；H&E和油紅O染色結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠主動脈根部可見內膜增厚，管腔明顯狹窄，有明顯粥樣斑塊形成，且存在大量脂滴沉積，油紅O 陽性面積占比較大（P＜0.01，圖2）。表明ApoE-/-小鼠AS 模型構建成功。

圖1 小鼠血清中TC、TG、HDL?C 和LDL?C 的含量Fig.1 Content of TC、TG、HDL?C and LDL?C in mice serum

圖2 小鼠主動脈根部橫切面H&E 和油紅O 染色（20×）Fig.2 Mouse aortic root cross sections were separately stained with H&E and Oil Red O（20×）

2.2 高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠主動脈組織中鐵死亡相關基因mRNA 和蛋白的表達采用qRT?PCR 及Western blot 分別檢測主動脈組織中鐵死亡相關基因表達情況，結果顯示，與對照組相比較，模型組p53的mRNA表達明顯上升（P＜0.01），GPX4和SLC7A11的mRNA 表達呈降低趨勢（均P＜0.05，圖3）。蛋白表達與上述mRNA 表達改變相一致（P＜0.05，圖4）。證實高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠AS 中鐵死亡的發生。

圖3 小鼠主動脈組織中鐵死亡相關基因的mRNA 表達Fig.3 The mRNA expression of ferroptosis?related genes in mice aorta

圖4 對照組和模型組中鐵死亡相關基因的蛋白表達Fig.4 The protein expression of ferroptosis?related genes in mice aorta

2.3 RAW264.7 巨噬細胞源性泡沫細胞模型的建立選擇大小均一、生長狀態良好的RAW264.7 巨噬細胞，用含50 mg/L 的ox?LDL 刺激后通過油紅O觀察，胞漿中有紅色脂滴，由此泡沫細胞模型建立成功，見圖5。

圖5 建立RAW264.7 巨噬細胞源性泡沫細胞模型（20×）Fig.5 Establishment of RAW264.7 macrophage?derived foam cell model（20×）

2.4 ox?LDL 誘導的泡沫細胞發生鐵死亡為了進一步明確鐵死亡在泡沫細胞中的作用，采用qRT?PCR 及Western blot 分別檢測兩組細胞中鐵死亡相關基因的表達情況。與Control 組相比，Ox?LDL 組GPX4 和SLC7A11 mRNA 表達水平顯著降低（均P＜0.01），而p53 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01），見圖6。隨后檢測了p53、GPX4 和SLC7A11 蛋白表達，與Control 組相比，Ox?LDL 組p53 蛋白表達升高（P＜0.001），GPX4 和SLC7A11表達水平降低（均P＜0.01），說明ox?LDL 誘導的泡沫細胞有鐵死亡發生，見圖7。

圖6 Control 組和Ox?LDL 組中鐵死亡相關基因的mRNA 表達Fig.6 The mRNA expression of ferroptosis?related genes in Control and Ox?LDL groups

2.5 ox?LDL 誘導的泡沫細胞中脂質過氧化物和鐵含量增加觀察兩組細胞內脂質過氧化物、GSH 和鐵離子水平變化，結果顯示，與Control 組相比，Ox?LDL 組細胞ROS、MDA 表達水平明顯增高（均P＜0.01），而GSH 含量顯著降低（P＜0.01），Fe2+含量升高（P＜0.05），見圖8。

3 討論

隨著AS 的發生發展，泡沫細胞逐漸在動脈內膜中堆積形成脂質斑塊，當動脈壁中的脂質斑塊發生破裂，繼發血栓形成，導致各種急慢性心血管疾病事件及其他并發癥發生［6-8］。巨噬細胞/泡沫細胞死亡是晚期斑塊的突出特征，也是導致壞死核心形成和斑塊不穩定的主要因素。脂質過氧化是導致AS 的關鍵危險因素。鐵累積和脂質過氧化是鐵死亡發生的重要機制，也是AS 發病的重要危險因素［9］。因此探究鐵死亡與AS 的關系，對于AS 的機制研究與防治具有重要意義。

圖7 Control 組和Ox?LDL 組中鐵死亡相關基因的蛋白表達Fig.7 The protein expression of ferroptosis?related genes in Control and Ox?LDL groups

圖8 ox?LDL 誘導的泡沫細胞中ROS、MDA、GSH 和Fe2+表達水平的影響Fig.8 The content of ROS，MDA，GSH and Fe2+in ox?LDL?induced foam cell

有研究發現，在高脂飲食喂養的ApoE-/-小鼠AS 模型的肝細胞損傷過程中有鐵死亡發生［10］。細胞內脂質過氧化物積累導致細胞膜磷脂過氧化是細胞鐵死亡的關鍵驅動因素［11］，而抗氧化劑GPX4/GSH 體系在抑制這種脂質過氧化反應中發揮重要作用［12］。SLC7A11 是谷氨酸/胱氨酸轉運體系統（System Xc-）的一個組成部分［13］，攝入的胱氨酸合成GSH 通過與GPX4 結合，發揮清除脂質過氧化產物的作用。抑制Xc?轉運系統導致合成GSH的前體半胱氨酸嚴重耗竭并伴隨細胞內抗氧化能力不足，同時GSH 依賴的酶如GPX4［14］活性也會下降。p53 則可通過抑制SLC7A11 表達、增加ROS 的生成，來加快鐵死亡進程［15］。基因和蛋白結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠SLC7A11 和GPX4表達水平顯著降低，而p53 的表達水平則顯著上升，提示鐵死亡參與高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠AS的發生發展過程，但具體機制有待進一步研究。

在AS 斑塊中，泡沫化的巨噬細胞發生凋亡或非凋亡形式的程序性死亡，釋放形成壞死核心的細胞成分和脂質，是導致AS 斑塊不穩定和易損的關鍵病理因素之一［16］。故本研究推測，泡沫細胞形成過程可能有鐵死亡發生。結果顯示，使用ox?LDL 處理后，Western blot 及qRT?PCR 檢測到泡沫細胞中p53 表達水平增加，SLC7A11 和GPX4 的表達水平降低，并且細胞損傷和脂質過氧化作用加重，表現為ROS、MDA 的生成增加，抗氧化劑GSH 的減少，細胞內的鐵離子水平也有所升高。結果提示ox?LDL 誘導的RAW264.7 巨噬細胞來源泡沫細胞中有鐵死亡發生。

綜上所述，本研究結果表明在高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠AS 中有鐵死亡的參與，且ox?LDL 誘導RAW264.7 巨噬細胞泡沫化過程中有鐵死亡參與。故針對死亡類型的藥理學靶向方法是穩定易損斑塊的一種有前途的方法，但泡沫細胞鐵死亡在AS 中的具體作用機制，還需更進一步的研究。