miR?488?3p在子癇前期胎盤滋養層細胞侵襲和遷移中的作用研究

吳琪瑞 王艷華 劉林英 高麗娜 殷荷 張玉月 韓可棟 張慧萍，4，5

寧夏醫科大學1臨床醫學院，2總醫院，3基礎醫學院（銀川750004）；4國家衛生健康委代謝性心血管疾病研究重點實驗室；5寧夏血管損傷與修復研究重點實驗室（銀川750004）

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種多系統受累的妊娠特異性綜合征，是導致孕產婦發病和死亡的主要原因之一［1］。研究發現，PE 會增加孕婦發生肺水腫、羊水栓塞、急性腎功能衰竭和死亡的風險；同時，也會增加新生兒不良結局的風險，如早產、流產、呼吸窘迫綜合征和死亡等，嚴重威脅母嬰健康［2-3］。然而，PE 的發病機制目前尚不清楚，亟待進一步研究。MicroRNA（miRNA）是一種長度約為22 個核苷酸的小的單鏈非編碼RNA，參與調節人類細胞中約三分之一的蛋白質編碼基因，通過抑制mRNA 翻譯和降低mRNA 穩定性來調節基因表達從而參與細胞增殖、分化和凋亡等一系列生命活動［4-5］。有文獻報道［6-7］，與正常孕婦相比，PE 患者胎盤和血清中的某些miRNA 存在差異表達，提示miRNA 可能參與了PE 的發生發展。其中，miR?488?3p 已被證實在多種癌癥中是一種腫瘤抑制因子，但其在PE 中的作用尚不清楚。故本研究探討miR?488?3p 在人胎盤滋養層細胞侵襲和遷移中的作用，并進一步探討其在PE 中的臨床價值，為PE 的診斷及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年1月至2018年2月寧夏國龍婦產醫院收治的PE 患者30 例和同期健康妊娠分娩的正常孕婦（normal pregnancy，NP）30 例。納入標準：妊娠20 周后出現收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg，同時伴有蛋白尿（尿蛋白≥0.3 g/24 h 或隨機尿蛋白≥+），且無消耗性疾病。組織標本收集前征得所有孕產婦同意并簽署知情同意書，組織收集后均凍存于-80 ℃冰箱。本實驗經寧夏醫科大學總醫院倫理委員會審查批準。NP和PE 組臨床資料比較，除孕婦年齡和孕周外，差異均具有統計學意義。見表1。

表1 NP 和PE 組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical data between NP and PE groups x±s

1.2 主要試劑人絨毛膜滋養層細胞（HTR?8/SV?neo）購于上海復旦細胞庫；胎牛血清、RPMI?1640培養基（美國，Gibco）；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液（北京，索萊寶）；總RNA 提取試劑盒（北京，天根）；逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒（日本，Taka?ra）；Matrigel 基質膠（美國，BD）；Transwell 小室（美國，Corning）；miR?488?3p mimic 及NC 和miR?488?3p inhibitor 及NC（上海，吉瑪）；miR?488?3p 和U6引物由廣州銳博公司合成，MMP2 和GAPDH 引物由上海生工公司合成，序列見表2。

表2 MMP2 和GAPDH 引物序列Tab.2 MMP2 and GAPDH primer sequences

1.3 細胞培養及轉染在37 ℃、5%CO2的培養箱中，使用含有7%胎牛血清、100 μg/mL 青鏈霉素的RPMI?1640 培養基培養滋養層細胞，細胞長至90%融合度時用胰蛋白酶進行傳代，每1 ～2 d換一次培養液。同時，待培養瓶中細胞長至60%～70%融合度時添加轉染試劑，細胞分5 組：con?trol、miR?488?3p NC、miR?488?3p mimic、inhibitor NC 和miR?488?3p inhibitor，培養4?6 h 后棄原培養基，更換新培養基培養48 h 后，收取細胞進行后續實驗。

1.4 細胞遷移實驗將轉染48 h 后的細胞重懸，計數，按1 × 105細胞/孔接種于Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含有15%血清的完全培養基，繼續培養48 h。取出小室，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，用棉簽擦去上室未遷移的細胞，晾干，100 倍倒置顯微鏡下計數并拍照，每個小室隨機取5 個視野進行計數。

1.5 細胞侵襲實驗提前將Matrigel 基質膠從-20 ℃取出放在4 ℃過夜使其融化，次日在冰上按照1∶8 的比例用無血清RPMI?1640 稀釋并混勻，加入Transwell 小室100 μL，搖勻，放入恒溫細胞培養箱過夜使膠凝固。余步驟與細胞遷移實驗相同。

1.6 Real?time PCR 檢測分別按照總RNA 提取試劑盒說明書提取胎盤組織和滋養細胞的總RNA，樣本OD260/280 控制在1.8 ～2.0，然后按照說明書逆轉錄合成cDNA，并置于熒光定量PCR 儀進行擴增，總體系為20 μL。

1.7 統計學方法所有實驗至少重復3 次，結果以表示，用Prism 7.0 統計軟件處理數據。兩組間差異采用獨立樣本t檢驗比較，多組間兩兩比較采用單因素方差分析，miR?488?3p 與PE 臨床特征的關系采用pearson 相關性分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR?488?3p 在PE 胎盤組織中的表達水平qRT?PCR 檢測結果顯示，與NP 組比較，PE 組miR?488?3p 的表達水平顯著升高（P＜0.01），提示miR?488?3p 在PE 患者胎盤組織中高表達，其可能參與PE 的發生發展，見圖1。

2.2 miR?488?3p 的表達水平與臨床特征的相關性分析如圖2，miR?488?3p 的表達水平與收縮壓（r= 0.377 2，P= 0.003 0）、舒張壓（r= 0.323 8，P=0.011 6）均有顯著正相關性，進一步提示miR?488?3p 與PE 密切相關，且miR?488?3p 的表達水平可能與PE 病情嚴重程度呈正相關。

圖1 miR?488?3p 在NP 和PE 胎盤組織中的表達水平Fig.1 Expression of miR?488?3p in placenta of NP and PE

圖2 胎盤組織中miR?488?3p 的表達與臨床特征的關系Fig.2 Relationship between expression of miR?488?3p and clinical features in placenta

2.3 miR?488?3p 對滋養層細胞侵襲能力的影響如圖3，mimic 組中miR?488?3p 表達高于mimic?NC組（P＜0.001），而inhibitor 組中的miR?488?3p 表達低于inhibitor?NC 組（P＜0.05），提示過表達miR?488?3p 及抑制miR?488?3p 細胞構建成功。Tran?swell 侵襲實驗結果顯示：與mimic?NC 組比較，mimic 組的侵襲細胞數明顯減少（P＜0.01）；相反，與inhibitor?NC 組比較，inhibitor 組的侵襲細胞數顯著增多（P＜0.01），提示過表達miR?488?3p 可抑制滋養層細胞的侵襲能力，而抑制miR?488?3p 后則相反，見圖4。

圖3 轉染miR?488?3p mimic 和inhibitor 后miR?488?3p 的表達Fig.3 Expression of miR?488?3p after transfection of miR?488?3p mimic and inhibitor

圖4 miR?488?3p 對滋養層細胞侵襲的影響Fig.4 Effect of miR?488?3p on trophoblast cells invasion

2.4 miR?488?3p 對滋養層細胞遷移能力的影響如圖5，轉染mimic 和inhibitor 后，滋養層細胞遷移能力的變化與侵襲能力呈現相同的趨勢，提示過表達miR?488?3p 可抑制滋養層細胞的遷移能力，而抑制miR?488?3p 后則相反。

2.5 生物信息軟件預測MMP2 是miR?488?3p 可能作用的靶基因軟件分析發現，MMP2 mRNA 3′UTR 與miR?488?3p 有結合位點，提示MMP2 可能是miR?488?3p 的下游靶基因，見圖6。

圖5 miR?488?3p 對滋養層細胞遷移的影響Fig.5 Effect of miR?488?3p on trophoblast cells migration

圖6 miR?488?3p 與MMP2 的預測結合位點Fig.6 Predicted binding sites of miR?488?3p and MMP2

2.6 MMP2 mRNA在PE胎盤組織中的表達qRT?PCR 檢測MMP2 在 上 述30 例PE 組 及30 例NP 組胎盤組織中的表達，結果如圖7，PE 組中MMP2 含量低于NP 組（P＜0.05）。MMP2 在胎盤組織中的表達水平與miR?488?3p 相反，提示miR?488?3p 可能對MMP2 有負向調節作用。

圖7 MMP2 在NP 和PE 胎盤組織中的表達水平Fig.7 Expression of MMP2 in placental tissues of NP and PE

2.7 miR?488?3p對滋養層細胞中MMP2表達的影響同時，qRT?PCR 結果顯示，與NC 組比較，過表達miR?488?3p 明顯抑制MMP2 的表達（P＜0.001）；相反，miR?488?3p 表達下調增加MMP2 的表達（P＜0.05），提示miR?488?3p 可能通過抑制MMP2的表達調控滋養層細胞的侵襲和遷移，見圖8。

圖8 miR?488?3p 對滋養層細胞中MMP2 表達的影響Fig.8 Effect of miR?488?3p on the expression of MMP2 in trophoblast cells

3 討論

PE 是一種以高血壓和蛋白尿為主要臨床表現的妊娠并發癥，它影響全世界2%至8%的孕婦，是孕產婦和新生兒死亡的主要原因［8］。目前臨床上，分娩是唯一已知的治愈方法，而其它治療手段只是起到控制病情和延緩孕周的目的［9］。近些年，隨著分子生物學和非編碼RNA的發展，miRNA的分子靶向精準治療為臨床PE治療提供了新的思路。

越來越多的數據證明，miRNA能夠參與調控滋養層細胞分化、遷移、侵襲、增殖、凋亡、血管生成和細胞代謝等多種生物學過程［10-12］。其中，miR?488?3p已被證實在食管鱗癌、小細胞肺癌等多種腫瘤組織中低表達，其作為一種腫瘤抑制因子參與腫瘤的發生發展［13-14］。同時，在急性痛風性關節炎等非腫瘤性疾病中miR?488?3p 也發揮著重要作用［15］。但關于miR?488?3p 在PE 中的表達及作用機制尚未見研究。本研究發現，miR?488?3p 在PE 胎盤組織中呈高表達，同時miR?488?3p 的表達水平與PE收縮壓、舒張壓正相關，提示miR?488?3p 的高表達與PE 的發生發展密切相關，并可能隨著PE 病情加重表達增加，同時，miR?488?3p 也可能成為PE治療的靶點及早期診斷的分子標記物。

臨床和病理研究表明胎盤在PE 的發病機制中處于中心地位；而滋養層細胞作為胎盤的主要成分，其浸潤不足是PE 最突出的病理特征，也是PE 發生發展的關鍵因素［16-17］。滋養層細胞的侵襲和遷移特性與腫瘤細胞相似，但不同的是滋養層細胞具有嚴格的時空限制和精細調控，同時僅限于子宮的早期妊娠［18］。本研究結果顯示，當miR?488?3p 抑制表達后，滋養層細胞的侵襲和遷移能力增強，相反，miR?488?3p 進一步誘導表達后滋養層細胞侵襲和遷移能力顯著減弱。

miRNA 通常在轉錄后水平調控基因的表達，參與多種生理過程［5］。本研究通過生物信息學分析發現MMP2 3′UTR 區與miR?488?3p 存在可結合的位點，推測MMP2 可能是miR?488?3p 的下游靶基因。MMP2 是基質金屬蛋白酶（MMPs）家族中的一員，能特異性降解Ⅳ型膠原酶等多種細胞外基質，從而為細胞的侵襲遷移提供有利條件。研究表明，在妊娠早期，MMP2 的減少干擾了妊娠早期螺旋動脈的正常重構，導致了PE 最初的病理生理變化［19］。本研究結果顯示MMP2 在PE 胎盤組織中的含量低于NP 組，與miR?488?3p 的表達水平負相關；同時，滋養層細胞中過表達miR?488?3p 能夠下調MMP2 的表達，而抑制miR?488?3p 則增加MMP2的表達，以上結果表明miR?488?3p 可能通過調控MMP2 調節滋養層細胞的侵襲和遷移。

綜上所述，本研究發現miR?488?3p 在PE 胎盤組織中高表達，且表達水平與PE 病情嚴重程度呈正相關；而抑制miR?488?3p 的表達水平能夠顯著增強滋養層細胞的侵襲和遷移能力，其機制可能與miR?488?3p 負向調控MMP2 有關。這將為PE 的發病機制開拓一個新的方向，同時，由于miRNA 本身的保守性，后續可以在PE 動物模型上敲除miR?488?3p，進一步探索其功能及作用機制，為PE 分子靶向精準治療提供新的靶點。