常規RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測GⅠ、GⅡ型諾如病毒方法的研究和應用

郭艷飛

（瓦房店市疾病預防控制中心，遼寧 大連 116300）

腹瀉是臨床公認的常見病和多發病，也是引起死亡的主要因素。現階段已證實，諾如病毒是引起嬰幼兒腹瀉的發病原因，主要以糞-口途徑進行感染，通過人與人之間傳播而引起更多人的感染，這不僅僅對食品衛生、人民健康造成較大威脅，也帶來較大的經濟損失[1]。諾如病毒是屬于杯狀病毒科，是導致非細菌性的急性胃腸炎重要病原體。據統計，世界范圍內約一半的暴發型胃腸炎由諾如病毒引起，其中GⅠ、GⅡ型是世界范圍內最常見的諾如病毒基因型，有全球流行的歷史[2]。在我國，感染諾如病毒也主要為GⅠ、GⅡ型。近幾年，由諾如病毒感染所致的胃腸炎疫情報道越來越多，成為重要的公共衛生難題。所以，快速、準確、特異的檢測方法對疾病的預防和控制具有重大意義。現階段還不能在體外進行諾如病毒培養，也缺少相關動物模型，其變異類型較多，檢測比較困難，也不容易進行鑒別，傳統的免疫學和血清學檢測方法受到較大限制[3]。分子生物學技術的推廣應用，給諾如病毒的檢測帶來較大福音。PCR技術是臨床上檢測基因的重要方式，也具有較大的優勢[4]。因此，本研究旨在比較常規RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測GⅠ、GⅡ型諾如病毒的效果，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年7月至2020年7月我院210例腹瀉患者糞便為研究對象，男性110例，女性100例，年齡3個月～13歲，平均年齡為（2.50±0.40）歲。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 收集入選者新鮮糞便，應用PBS制備成10%糞便混懸液，將其保持于-70 ℃低溫環境中待測。

1.2.2 引物與探針 引物和探針序列見表1。

1.2.3 病毒RNA提取盒cDNA合成 采用TIANamp Virus RNA Kit來提取病毒RNA，嚴格根據試劑盒說明進行操作，然后應用PrimeScriptTMRT-Reagent Kit對提取的病毒RNA進行逆轉錄，操作過程同樣嚴格按照試劑盒說明進行。

1.2.4 常規RT-PCR方法 應用正交設計優化最佳的PCR反應，選取最佳的退火溫度。優化以后的PCR體系為25 μL，組分主要有：2.5 μL10×PCR Buffer，0.5 U Taq酶，上下游的引物各自為1.25 μL，3.0 μLdNTP，3.0 μL cDNA，應用滅菌注射用水將其補足至25 μL。94 ℃預變性3 min，94 ℃條件變性30 s，54 ℃條件退火30 s，72 ℃條件延伸30 s，總共進行40循環，72 ℃條件最終延伸10 min。應用分光光度計來定量陽性GⅠ、GⅡ型諾如病毒RNA，應用建立RT-PCR檢測100～105copies/μL的病毒，分析病毒的最低檢測下限，同時對札幌病毒、星狀病毒、輪狀病毒等進行檢測，檢驗其特異性。

1.2.5 熒光定量RT-PCR方法 應用矩陣法來優選最優的熒光定量PCR體系。優化以后的PCR體系為20 μL，組分有：10 μL2×Premix Ex Taq，0.4 μL 50×R0x Reference Dye Ⅱ，上下游的引物各1.6 μL，其探針為0.8 μL，模板2.0 μL cDNA，應用滅菌注射用水將其補足至20 μL，反應的條件為：50 ℃條件2 min，95 ℃條件預變性30 s，95 ℃條件變性5 s，60 ℃條件退火34 s，總共進行40循環，在60 ℃條件下進行熒光信號收集。

表1 常規RT-PCR與熒光定量RT-PCR引物和探針

1.2.6 病毒標準曲線制作 用來制作標準曲線的標準品，是含GⅠ、GⅡ型諾如病毒的擴增片段，紫光分光光度計來測定其濃度，并依據質粒的分子量換算為拷貝數。將質粒倍比8個梯度，為101～108copies/μL，每個梯度均應用熒光PCR進行檢測，結束反應以后，通過收集的熒光信號值來繪制相應標準曲線。

1.2.7 臨床樣品檢測 應用建立的兩種PCR方法對采集的臨床樣品檢測，并且比較其檢測結果，檢測出陽性結果進行測序來驗證諾如病毒檢測的準確性。

2 結果

2.1 兩種檢測方法特異性 這兩種檢測方法特異性均較強，與輪狀病毒、札幌病毒、星狀病毒之間無交叉反應，相同體系GⅠ、GⅡ型諾如病毒之間無干擾。

2.2 兩種檢測方法下限比較 常規RT-PCR的最低檢測下限是103copies/μL，熒光定量RT-PCR的最低檢測下限是102copies/μL。

2.3 兩種檢測方法檢測率和符合率比較 常規RT-PCR的檢測率為5.71%（12/210），符合率為66.67%（12/18），熒光定量RT-PCR的檢測率為8.57%（18/210），符合率為100.00%（18/18）；對18例陽性樣本進行測序分析，均證實為諾如病毒。

3 討 論

病毒性腹瀉是非細菌性常見的常見病，腹瀉患者排泄物中含有大量致病病毒，容易引起腹瀉的大流行，嚴重威脅公眾的健康[5]。諾如病毒是引起病毒性腹瀉的常見病原體，該病原體主要經口傳播，也可以通過接觸傳播，具有較強的侵染力，其感染的劑量甚至可低至10～100個病毒粒子，傳播比較迅速，較容易導致暴發[6]。因此其檢測成為公共衛生檢測的重點之一。現階段，檢測諾如病毒的主要方法為電鏡法、免疫法以及分子生物法等，其中電鏡法為最早檢測方法，但是其靈敏度較低，樣品的處理過程比較復雜，要求具有較高的技術，不利于推廣應用[7]；免疫法多采用酶聯免疫吸附，檢測比較迅速，操作也相對簡單，但是其假陽性率比較高，檢出率也相對較低，也不是最佳的篩選方法；RT-PCR是分子生物學方法，該方法具有監測準確、迅速、靈敏度和特異性均較高的優勢，被首推為檢測的生物學方法。諾如病毒較容易出現變異，存在的類型也較多，GⅠ、GⅡ型是較常見的可以引起人類感染的類型，這兩種類型也存在14和17種基因亞型，因此對檢測提出較高要求，而引物設計也成為RT-PCR檢測的關鍵技術。

常規RT-PCR檢測方法每個反應只能擴增1個模板，并且需將擴增產物進行電泳分析，所以較容易產生PCR氣溶膠污染，導致結果出現假陽性[8]。近年來，熒光定量RT-PCR技術逐漸發展，該方法利用熒光信號探針和實時定量檢測相結合，是一種比較成熟的新技術，利用制備好的各個梯度陽性質量來控制樣品的擴增Ct值，結合起始模板對數繪制曲線，對反應體系中起始模板進行定量[9]。該方法可以有效避免常規RT-PCR方法中電泳帶來的污染。國內外研究發現，針對諾如病毒的引物和探針序列，以GI-SKF/GI-SKR、GII-SKF/GII-SKR為最佳引物，針對諾病毒的ORF1-ORF2連接處存在高度保守區基因設計引物（COGIF、COGIR、RINGI-TP、COG2F、COG2R、RINGII-TP），尤其對陽性的檢測樣品，該引物檢測的高達99%的靈敏度，是現階段靈敏度比較高的引物[7]。本研究通過觀察常規RT-PCR和熒光定量RT-PCR法檢測諾如病毒，研究發現建立的兩種方法檢測諾如病毒均具有較高的特異性。常規RT-PCR的最低檢測下限是103copies/μL，熒光定量RT-PCR的最低檢測下限是102copies/μL。熒光定量RT-PCR的最低檢測下限為常規RT-PCR的10倍，提示熒光定量RT-PCR檢測效果更佳，即使較低的病毒載量，也能有效檢測出來。通過比較兩種檢測方法檢測率和符合率發現，常規RT-PCR的檢測率為5.71%（12/210），符合率為66.67%（12/18），熒光定量RT-PCR的檢測率為8.57%（18/210），符合率為100.00%（18/18），充分說明熒光定量RT-PCR具有較高的符合率，可以較好的篩查出諾如病毒，有效避免遺漏，通過對檢出的陽性結果進行測序分析，結果發現均為諾如病毒。提示這兩種檢測方式均可以準確篩查出諾如病毒，未出現假陽性情況。但是，熒光定量RT-PCR具有更高的檢測效率，敏感性更高，若進行諾如病毒檢測，建議選取熒光定量RT-PCR。

綜上所述，常規RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測諾如病毒均具有較好的特異性，熒光定量RT-PCR不僅能定性檢測諾如病毒，還能進行定量分析，對病毒的致病劑量和風險進行評估，且檢測的符合率也較高，為避免遺漏，建議選取熒光定量RT-PCR。