胃癌中DNA 甲基化轉移酶3A 的表達與幽門螺桿菌感染的關系△

楊夢迪，王學紅，潘世銳，馬雪芹，郜茜，綻永華，李源化，李春霞，安琪

1青海大學研究生院，西寧 810001

2北京市海淀醫院重癥醫學科，北京 100089

3青海大學附屬醫院消化內科，西寧 810001

胃癌（gastric cancer，GC）是常見的消化道惡性腫瘤，其發生是幽門螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）感染、環境和遺傳等多因素共同作用的結果。據國際癌癥研究機構提供的全球癌癥觀察2018年數據估計，2018年胃癌的發病率位于全球惡性腫瘤第5位；因胃癌病死的病例約78.3萬，位于惡性腫瘤死亡率第3位；全球近一半的新發及死亡病例為中國病例，因此，中國是胃癌負擔較重的國家之一。Correa等提出的腸型胃癌發生模式（正常胃黏膜→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃癌）已獲得醫學界認同。Hp感染是胃癌發生的主要危險因素，并在腸型胃癌發生中起始動作用已成為共識。DNA甲基化受DNA甲基化轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的調控，被認為是腫瘤發生機制的重要組成部分。本研究以青海胃癌高發和Hp高感染為研究背景，通過檢測慢性非萎縮性胃炎（chronic non-atrophic gastritis，CNAG）、慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）、胃腺瘤（gastric adenoma，GA）和GC這4種不同疾病狀態下患者Hp感染情況及胃黏膜組織中DNA甲基化轉移酶3A（DNA methyltransferase 3 alpha，DNMT3A）mRNA的表達水平，從而探討兩者與胃癌發生、發展的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年11月至2020年5月于青海大學附屬醫院經胃鏡及病理檢查確診的CNAG、CAG、GA、GC患者的臨床資料。排除標準：①近4周內服用過鉍劑、抗生素、中藥及質子泵抑制劑（proton pump inhibitor，PPI）等影響Hp檢出情況的藥物者；②既往接受過Hp感染治療的非初次檢出者。根據納入和排除標準，本研究共納入CNAG、CAG、GA、GC患者各30例。CNAG患者中，＞60歲12例，≤60歲18例；男20例，女10例。CAG患者中，＞60歲15例，≤60歲15例；男13例，女17例。GA患者中，＞60歲14例，≤60歲16例；男12例，女18例。GC患者中，＞60歲16例，≤60歲14例；男19例，女11例。4種胃部疾病患者的性別與年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 胃黏膜樣本采集 自GC、GA、CAG和CNAG患者的病變部位分別取胃黏膜組織標本兩塊，將離體胃黏膜取出后，立即置入凍存管于液氮中速凍，24 h后取出置入-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.2.2 主要試劑及儀器 2xTaqMan Fast qPCR Master Mix、4SRed Plus核酸染色劑（10 000×水溶液）、瓊脂糖均購自BBI生命科學有限公司，UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，GeneRuler DNA Ladder Mix、Maxima Reverse Transcriptase均 購 自 美 國Thermo Scientific公司，FR-980型聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀購自上海復日科技有限公司。

1.2.3 PCR檢測DNMT3AmRNA的表達 取凍存標本，每15～25 mg凍存樣本中加入0.5 ml Trizol試劑，通過凝膠成像系統觀察RNA的完整性，采用SMA4000微量分光光度計檢測樣本含量及純度，嚴格按照反轉錄實驗說明書于PCR儀進行反轉錄。采用實時熒光定量PCR檢測DNMT3A mRNA的相對表達量。以GAPDH作為內參基因。GAPDH的上游引物為5'-TGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3'，下游引物為5'-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3'；DNMT3A上游引物為5'-GCACTGAAATGGAAAGGG-3'，下游引物為 5'-AAGAGGTGGCGGATGACT-3'。采用 2法計算各樣本的相對表達量。

1.2.4 Hp 的檢測與判定 采用C尿素呼氣實驗判定患者的Hp感染情況，操作步驟嚴格按照說明書步驟進行，結果數值＞4 dpm提示陽性，即為Hp感染。

1.3 觀察指標

比較不同胃部疾病患者胃黏膜組織中DNMT3A mRNA的相對表達量。分析DNMT3A mRNA在不同Hp感染性胃部疾病中的表達情況，以及不同臨床特征GC患者GC組織中DNMT3A mRNA的相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計學分析，DNMT3A的相對表達量呈偏態分布，以中位數及四分位數[M（P，P）]表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，多組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同胃部疾病患者胃黏膜組織中DNMT3A mRNA相對表達量的比較

CNAG、CAG、GA、GC患者胃黏膜組織中DNMT3A mRNA的相對表達量分別為0.70（0.49，1.38）、0.90（0.58，1.80）、1.60（0.74，3.28）、1.70（1.09，3.36）。4組胃部疾病患者胃黏膜組織中DNMT3A mRNA的相對表達量比較，差異有統計學意義（H=22.211，P＜0.01）。隨著病情的發展（由輕到重依次為CNAG、CAG、GA、GC），DNMT3A mRNA的相對表達量呈逐漸升高趨勢。GC患者胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對表達量高于CAG和CNAG患者，GA患者胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對表達量高于CNAG患者，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。GC與GA、GA與CAG、CAG與CNAG患者之間胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對表達量比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。

2.2 DNMT3AmRNA在不同Hp 感染性胃部疾病中的表達情況比較

在同種疾病胃黏膜組織中，Hp感染胃部疾病患者胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對表達量均高于非Hp感染胃部疾病患者，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。（表1）

表1 DNMT3A mRNA在不同Hp感染性胃部疾病中的表達情況比較

2.3 不同臨床特征GC患者GC組織中DNMT3A mRNA 相對表達量的比較

低分化、伴有淋巴結轉移的GC患者GC組織中

DNMT3A

mRNA的相對表達量分別高于高中分化、不伴淋巴結轉移的GC患者，差異均有統計學意義（

P

＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、遠處轉移情況、TNM分期GC患者GC組織中

DNMT3A

mRNA的相對表達量比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征GC患者GC組織中DNMT3A mRNA相對表達量的比較（n=30）

3 討論

在腫瘤發生的過程中，DNA甲基化是表觀遺傳學中調節基因表達的一種重要方式，受DNA甲基化轉移酶的調控，在DNA序列中加入或減去胞嘧啶殘基，從而形成5-甲基胞嘧啶。生理狀態下，CpG島區處于非甲基化狀態，但當發生癌變時，有害因素會刺激CpG島，使局部發生甲基化，引起表觀遺傳沉默，從而導致抑癌基因失活，這被認為是腫瘤發生機制的重要組成部分。近年來，大量研究證明，在胃癌的發生、發展和轉移的過程中，DNA甲基化通過基因修飾和基因調節等發揮重要作用。DNMT3A具有組織特異性，主要通過催化基因組序列使DNA從頭甲基化，建立新的甲基化模式，是腫瘤基因組DNA異常甲基化的重要原因。本研究結果表明，DNMT3A的相對表達量呈逐漸升高趨勢，GC患者胃黏膜組織中DNMT3A的相對表達量高于CNAG和CAG患者，這一結果與Cao等的研究結果一致。本研究納入了癌前胃部疾病患者，發現GA患者胃黏膜組織中DNMT3A的相對表達量較CNAG患者高，但GA患者胃黏膜組織中DNMT3A的相對表達量低于GC組，但差異無統計學意義（

P

＞0.05），提示DNMT3A在GA的發生過程中可能發揮了一定作用。本研究亦表明，DNMT3A表達的上調在胃癌前期即參與了胃癌的發生，且從慢性炎癥、癌前病變發展至惡性腫瘤也是一個從量變到質變的過程。然而，動態檢測胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的表達情況是否有助于早期胃癌的發現仍需要進一步研究。Hp感染誘導表觀遺傳改變與胃癌相關基因的異常DNA甲基化有關。在非家族遺傳性散發性GC中，慢性Hp感染是主要的驅動事件，約90%的非賁門胃癌新發病例與此種細菌有關。已有研究發現，由Hp感染引起胃黏膜的表觀遺傳畸變是GC發生的早期組成部分，甚至可能先于經典遺傳突變的發生。同時，研究表明，Hp感染可增強胃黏膜DNA異常甲基化，可能是Hp的致癌機制。Nakajima等發現Hp感染誘導特異性異常DNA甲基化并促進胃癌的發生，但不改變

DNMT3A

mRNA和蛋白的表達。Cao等發現

DNMT3A

rs1550117位點的多態性與Hp的感染風險增加顯著相關，但與CAG或GC的發生無明顯相關性；而

DNMT3A

rs13420827位點的多態性與Hp感染及CAG或GC的發生均無明顯相關性。Yan等發現，胃癌中存在氧化還原酶的雙色氨酸域基因（WW domain-containing oxi-doreductase，WWOX）的高甲基化，且與Hp感染具有顯著相關性；進一步進行驗證，發現GC細胞株與Hp共培養可誘導

WWOX

啟動子甲基化，且DNMT1和DNMT3A的表達增強。Ding等發現通過根除Hp治療可降低胃癌組織中核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）等的甲基化水平。但是，目前，關于Hp與DNMT3A在GC中的相關性，學者們意見不一，可能因為Hp對

DNMT3A

基因不同單核苷酸多態性的作用不同，Hp可能不直接改變GC中DNMT3A的表達水平，而是通過多位點、多基因、多通路使DNMT3A的表達水平發生改變，這也說明其關系的復雜性及深入研究的必要性。本研究探討了同一胃部疾病患者胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的表達情況與Hp感染的關系，發現Hp感染的GC、GA、CAG和CNAG患者的胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對表達量均高于非Hp感染的同種疾病，提示Hp感染可上調胃黏膜組織中DNMT3A的表達。通過對比Hp感染的4種不同胃部疾病狀態患者胃黏膜組織中

DNMT3A

mRNA的相對表達量發現，GC患者胃黏膜組織中DNMT3A的相對表達量高于CAG和CNAG患者。結合DNMT3A在不同胃部疾病患者胃黏膜組織中的表達情況，本研究也證實胃癌的進展涉及長期反復發生的慢性炎癥、腸化等病理狀態及腺瘤等癌前疾病，而胃黏膜上皮細胞Hp的定植會導致炎癥性癌前病變的發生，在誘導Correa模式的演變過程中，通過一定機制在早期即促進啟動子CpG島區

DNMT3A

的甲基化表達，從而進一步引起基因修飾等的改變，參與抑癌基因失活的過程，逐漸導致胃癌發生。本研究初步證實了Hp感染促進胃黏膜組織中DNMT3A高表達的可能性，也間接證實了胃癌高發與Hp高感染有關。因此，通過規范抗Hp治療才能根除Hp，從而預防胃癌。但值得指出的是，本研究中，胃癌患者與非胃癌患者的Hp感染率無顯著性差異，這可能是因為本研究納入的樣本量較少，對于結果的把握度不足，有可能產生了假陰性結果，后續研究中將擴大樣本量，避免此類Ⅱ型錯誤發生，且后期將進行關于根除Hp后DNMT3A表達變化的研究。本研究發現，不同性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤深度分期、遠處轉移情況、TNM分期GC患者GC組織中

DNMT3A

mRNA分期的相對表達量比較，差異均無統計學意義（

P

＞0.05）。但低分化、伴有淋巴結轉移的GC患者GC組織中

DNMT3A

mRNA的相對表達量分別高于高中分化、不伴淋巴結轉移的GC患者，差異均有統計學意義（

P

＜0.05），這與Yang等的研究結果一致，與其他DNMT相比，DNMT3A的高表達亦可能通過作用于某些通路或其他靶基因參與腫瘤細胞的分化及淋巴結轉移，進而促進GC的發展。綜上所述，Hp感染胃黏膜上皮細胞后，可誘導

DNMT3A

mRNA高表達。Hp感染及DNMT3A高表達可協同作用，通過不同途徑參與從正常胃黏膜上皮細胞向癌前疾病甚至胃癌方向發展的過程。DNMT3A表達的上調可能促進癌前病變進展為胃癌，且其高表達與胃癌的發展密切相關。本研究為探索胃癌高發情況以及DNMT3A、Hp在GC中的致病機制提供了一定理論和實驗依據。