丙泊酚對滋養細胞增殖、侵襲的影響及相關機制研究

劉佳

滋養細胞來自胚胎外滋養層，具有滋養功能，妊娠早期滋養細胞侵入母體蛻膜間質與血管，使螺旋動脈發生重鑄，保證胎盤正常形成與妊娠進展[1]。滋養細胞與惡性腫瘤細胞有諸多相似性，高度增殖、侵襲遷移及逃避免疫系統攻擊，在流產、先兆子癇等妊娠病理情況中發揮重要作用[2]。丙泊酚是臨床常用麻醉劑，有研究顯示，丙泊酚可降低流產率，逆轉流產胎盤，蛻膜結構的病理改變，可能對滋養細胞的惡性增殖發揮抑制作用[3,4]。磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol kinase，PI3K)是生長因子激活的受體酪氨酸激酶和G蛋白受體重要的下游信號成分。研究顯示多種母胎界面的生長因子可激活PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路促進細胞增殖、侵襲過程[5,6]，丙泊酚是否通過PI3K/Akt信號通路對滋養細胞增殖、侵襲功能進行調控。本研究通過體外培養滋養細胞系JEG-3，檢測丙泊酚對JEG-3細胞增殖、侵襲的影響，并使用PI3K抑制劑LY294002進行實驗，旨在探討丙泊酚對滋養細胞惡性增殖的調控作用，為丙泊酚的合理利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：人細胞外滋養細胞株JEG-3購自中國科學院上海生物研究所。主要試劑及來源：12%胎牛血清、胰酶、DMEM/F12培養基購自上海語純生物科技有限公司；CCK8相關試劑購自上海翊圣生物有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購自美國sigma公司；鼠抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、金屬基質蛋白酶2(metallopro-teinase 2，MMP-2)、金屬基質蛋白酶9(metalloproteinase 9，MMP-9)、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH一抗及辣根過氧化物酶標記羊抗鼠免疫球蛋白購自上海強耀生物科技有限公司；Transwell相關試劑購自美國BD公司；ECL化學發光劑試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；核酸蛋白測定儀及凝膠成像儀購自德國Eppendorf公司；CO2培養箱購自上海丙林電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:以5×105/cm2密度接種于培養瓶中，使用含有12%胎牛血清的DMEM/F12培養基中培養，待細胞融合胰酶消化，PBS洗滌傳代。以5×105/cm2接種于6孔板，使用無血清培養基培養細胞。

1.2.2 細胞分組:加入不同濃度的丙泊酚(1 μg/ml、4 μg/ml、7 μg/ml)，以未加丙泊酚處理細胞作為對照組，于37℃、5% CO2條件下培養。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力:收集1.2.2中各組培養細胞，分別接種至96孔板中，常規培養24、48、72 h后，加入CCK-8試劑，4 h后在酶標儀上測定450 mn 處的吸光度值。每組均6個復孔。

1.2.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力:Transwell侵襲實驗：將基質膠與不含血清的RPMI-1640培養基按1∶8的比例混合稀釋后包被在上層小室并風干過夜，在上室中接種1.2.2中各組重懸細胞(細胞密度2×106/ml)，下室加入600 μl RPMI-1640培養基(含10%的FBS)。培養24 h后去除小室，棉簽擦除上室基質膠與細胞，甲醛固定15 min后0.1%結晶紫染色，用倒置顯微鏡隨機選取5個視野并拍照，取平均值。Transwell遷移試驗：除不加入基質膠外，其他步驟與侵襲試驗完全相同。

1.2.5 免疫印跡法(western blotting，WB)檢測細胞增殖、侵襲相關蛋白表達:收集1.2.2中各組細胞，經蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，通過BCA蛋白試劑盒檢測細胞總蛋白含量，取蛋白樣品10～20 μl，經凝膠分離后，轉移至PVDF膜上，封閉1 h，加入一抗，均為1∶1 000稀釋，4℃過夜；TBST洗滌后，加入二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育1～2 h，經ECL底物化學發光顯色后曝光顯影，Tanon 600圖像分析系統拍照并進行定量分析。實驗重復6次，取平均值。

1.2.6 PI3K/Akt信號抑制劑對細胞增殖、侵襲遷移的影響:收集1.2.2中對照組細胞及丙泊酚7 μg/ml組細胞，各自分成2份，其中1份不做處理，另1份加入終濃度為30 μmol/L的PI3K/Akt信號通路特異性抑制劑LY294002共培養，按照1.2.3與1.2.4中方法檢測各組細胞增殖、侵襲遷移能力，按照1.2.5中方法檢測細胞PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達。

2 結果

2.1 滋養細胞增殖能力測定 與對照組比較，同一時間內丙泊酚1 μg/ml組、丙泊酚4 μg/ml組、丙泊酚7 μg/ml組增殖抑制率依次升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與24 h相比，48 h與72 h細胞增殖抑制率顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，同一濃度下48 h與72 h間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同濃度丙泊酚對JEG-3細胞增殖抑制率的影響

2.2 不同濃度丙泊酚對滋養細胞侵襲、遷移的影響 與對照組比較，丙泊酚1 μg/ml組、丙泊酚4 μg/ml組、丙泊酚 7 μg/ml組侵襲、遷移細胞數顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與丙泊酚1 μg/ml組比較，丙泊酚4 μg/ml組、丙泊酚7 μg/ml組侵襲遷移細胞數顯著下降(P<0.05)；與丙泊酚4 μg/ml組比較，丙泊酚7 μg/ml組侵襲遷移細胞數顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1,表2。

對照組 丙泊酚1 μg/ml組 丙泊酚4 μg/ml組 丙泊酚7 μg/ml組

表2 Transwell實驗檢測丙泊酚對細胞侵襲、遷移能力的影響 n=6,個，

2.3 不同濃度丙泊酚對增殖、侵襲遷移相關蛋白表達影響 與對照組比較，丙泊酚處理各組PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達均顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與丙泊酚1 μg/ml處理組比較，丙泊酚4 μg/ml、丙泊酚7 μg/ml處理組的PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與丙泊酚4 μg/ml處理組比較，丙泊酚7 μg/ml處理組的PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2,表3。

對照組 丙泊酚1 μg/ml組 丙泊酚4 μg/ml組 丙泊酚7 μg/ml組

表3 丙泊酚對PCNA、MMP-2、MMP-9及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt表達影響

2.4 PI3K/Akt通路抑制劑對JEG-3細胞增殖、侵襲遷移的影響 與對照組比較，抑制劑組、丙泊酚組、丙泊酚+抑制劑組細胞增殖抑制率均顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)，侵襲、遷移細胞數均顯著減低，差異有統計學意義(P<0.05)；與抑制劑組比較，丙泊酚組細胞抑制率、侵襲細胞數、遷移細胞數差異無統計學意義(P>0.05)，丙泊酚+抑制劑組細胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05)，侵襲、遷移細胞數顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+抑制劑組細胞增殖抑制率顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)，侵襲、遷移細胞數顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3,表4。

對照組 抑制劑組 丙泊酚7 μg/ml組 丙泊酚+抑制劑組

表4 PI3K/Akt通路抑制劑對A431細胞增殖、侵襲遷移的影響

2.5 PI3K/Akt通路抑制劑對JEG-3細胞增殖、侵襲遷移及PI3K/Akt通路相關蛋白表達影響 與對照組比較，抑制劑組、丙泊酚組、丙泊酚+抑制劑組PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與抑制劑組比較，丙泊酚組PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，丙泊酚+抑制劑PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與丙泊酚組比較，丙泊酚+抑制劑組PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4,表5。

對照組 抑制劑組 丙泊酚7 μg/ml組 丙泊酚+抑制劑組

表5 PI3K/Akt通路抑制劑對JEG-3細胞增殖、侵襲遷移及PI3K/Akt通路相關蛋白表達影響

3 討論

滋養細胞可向母體子宮壁內浸潤，當其生長的精確時空調控被打破，可形成滋養細胞腫瘤，促使胚胎由良性葡萄胎向侵蝕性葡萄胎、絨癌轉化，早期可經血運傳播轉移，嚴重威脅女性健康。丙泊酚為烷基酸類短效靜脈麻醉藥物，在臨床中常用。研究顯示，丙泊酚對肝癌、胃癌等惡性腫瘤有抗腫瘤作用，但在滋養細胞腫瘤中研究較少，本研究通過探討丙泊酚對滋養細胞JEG-3增殖、侵襲遷移作用并探討可能機制，為滋養細胞腫瘤的治療提供理論基礎。

臨床中，丙泊酚作為麻醉劑血漿濃度為3～8 μg/ml，根據文獻及預試驗結果[7]，本研究選取丙泊酚濃度分別為1、4、7 μg/ml。研究顯示，丙泊酚對多種惡性腫瘤細胞增殖具有明顯抑制作用，如胰腺癌、宮頸癌等[8,9]。本研究發現丙泊酚作用JEG-3細胞48 h、72 h時，細胞增殖抑制率顯著升高，且隨丙泊酚劑量的增加(1、4、7 μg/ml)增殖抑制率升高，提示丙泊酚對抑制JEG-3細胞增殖具有一定抑制作用，同一濃度下處理48 h與72 h差異無統計學意義(P>0.05)，因此，后續試驗選取丙泊酚處理48 h。PCNA與細胞DNA合成密切相關，在細胞增殖啟動上發揮重要作用，其異常高表達是腫瘤惡性增殖的標志之一[10]。本研究中丙泊酚處理后，JEG-3細胞中PCNA蛋白表達隨丙泊酚濃度升高依次降低，提示丙泊酚可抑制滋養細胞惡性增殖。

有研究指出，臨床相關濃度的丙泊酚可減少人肺癌、前列腺癌細胞侵襲能力[11,12]。Xu等[13]研究顯示，丙泊酚處理可通過抑制細胞外調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路激活，降低MMP-2/MMP-9蛋白表達，發揮抑制食管鱗狀細胞癌細胞ECA-109侵襲能力。本研究Transwell小室試驗顯示，隨丙泊酚劑量增加，侵襲、遷移細胞數依次降低，提示丙泊酚可抑制JEG-3細胞侵襲與遷移，且呈劑量依賴效應。研究表明，MMP-2、MMP-9可降解細胞外基質，促進腫瘤細胞遷移、侵襲，是癌細胞重要侵襲轉移調控因子[14-16]。研究發現在惡性葡萄胎組織中MMP-2、MMP-9陽性表達顯著高于良性葡萄胎患者，推測其可作為滋養細胞浸潤早期的診斷標志物[17]。本研究結果顯示JEG-3細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達隨丙泊酚濃度升高而降低，提示丙泊酚可能通過影響MMP-2、MMP-9蛋白表達抑制細胞侵襲、遷移過程。

PI3K/Akt信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞功能調節，在許多惡性腫瘤中PI3K持續激活，促進惡性腫瘤的惡性轉化[18,19]。研究顯示，阻斷PI3K/Akt信號通路傳導可抑制滋養細胞腫瘤增殖與轉移[20]。本研究中，經丙泊酚處理后，JEG-3細胞中PI3K及Akt蛋白磷酸化水平呈劑量依賴性降低，提示丙泊酚可能抑制PI3K/Akt通路活化。添加PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002后，結果發現與丙泊酚組相比增殖、侵襲遷移及相關蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，提示丙泊酚處理與添加通路抑制劑效果相當，丙泊酚+抑制劑組JEG-3細胞增殖抑制率進一步升高、侵襲遷移細胞數進一步降低，PCNA、MMP-2、MMP-9、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著下降，進一步提示丙泊酚可能通過抑制PI3K/Akt信號通路活化發揮抑制JEG-3細胞增殖與侵襲遷移作用。

綜上所述，丙泊酚可能通過抑制PI3K/Akt信號通路活化，抑制滋養細胞JEG-3細胞增殖、侵襲遷移，為滋養細胞腫瘤的治療提供新的依據。但本研究也存在一定不足，滋養細胞惡性增殖過程十分復雜，PI3K/Akt可能僅為發揮作用的其中一個通路，有關丙泊酚抑制滋養細胞惡性增殖、侵襲相關機制有待進一步研究。