響應面法優化超聲提取-原子吸收光譜法測定海魚中的鉻

鄧政義

（錦州市疾病預防控制中心理化檢驗科， 遼寧 錦州121000）

海魚種類豐富、 味道鮮美、 營養價值高， 深受人們喜愛， 是百姓餐桌上常見的菜肴。 但近年來海洋污染日益嚴重， 特別是重金屬超標現象普遍存在［1］， 而處于海洋生物食物鏈頂端的海魚最容易富集重金屬， 并通過食物鏈進入人體［2］。 鉻（Cr） 是人體內必需的微量元素， 但如果長期攝入量超過一定值， 也會對人體造成危害［3］。 有研究顯示， 遼西地區食用魚中Cr 等元素的每周可耐受攝入量（PTWI） 約為10%， 經常食用仍存在潛在危害［4］。 因此對海魚樣品中重金屬含量的測定是十分必要的。 食品中重金屬消解的常用方法主要有濕式消解法［5］、 干法灰化法［6］和微波消解法［7］等， 但這些方法存在著消解時間長、 精密度低、需要高溫高壓條件等問題。 超聲提取法通過超聲波在樣品內部的“空穴” 作用， 產生強烈的機械破碎、 攪拌、 振動、 空化等作用［8］， 加速樣品的溶出， 縮短預處理時間， 提高樣品提取率， 有利于大批量樣品的快速處理［9-10］。 因此， 本研究建立一種簡便快速， 且適用于魚類樣品中Cr 測定的方法—超聲提取-原子吸收光譜法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器 市售海魚（帶魚、 黃花魚）；硝酸（HNO3）、 高氯酸（HClO4）、 30%過氧化氫（H2O2）； 1 000 μg／ml Cr 標準溶液（國家有色金屬及電子材料分析測試中心）； GBW08573 黃魚（國家標準物質中心）。

WYS2200 型原子吸收分光光度計（安徽皖儀科技股份有限公司）， KQ-100DB 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）， 電熱板（常州國宇儀器制造有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲提取法 準確稱取一定量的海魚樣品于離心管中， 加入7 ml HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V）， 70 ℃下超聲提取20 min， 4 000 r／min 離心5 min， 取上清液于電熱板蒸發至約1 ml； 殘渣經超純水清洗后再超聲提取2 min， 4 000 r／min 離心5 min， 取上清液合并于上述酸提取液中， 去離子水定容于10 ml 比色管中， 同時作空白試驗。

1.2.2 濕式消解法 準確稱取一定量海魚樣品于高腳燒杯中， 并放入數粒玻璃珠， 加10 ml HNO3-HClO4（9 ∶1， V／V） 加蓋浸泡8 h 并于電熱板上加熱， 直至冒白煙并且消化液呈透明， 將過量的混酸蒸發近干。 冷卻， 用滴管將消化液移入10 ml 容量瓶中， 去離子水定容， 混勻備用， 同時作空白試驗［11］。

1.2.3 石墨爐原子吸收光譜法（GFAAS） 測定Cr的含量 測定條件： 波長258.2 nm， 狹縫0.4 nm，燈電流10 mA， 干燥溫度110 ℃， 干燥時間15／15 s； 灰化溫度1 000 ℃， 灰化時間5／10 s； 原子化溫度2 600 ℃， 原子化時間2／3 s； 高溫清洗溫度2 650 ℃， 清洗時間3／3 s。

1.3 實驗設計

1.3.1 單因素試驗 分別考察超聲時間、 超聲溫度、 樣品量和溶劑體積4 個影響海魚中Cr 提取濃度的影響， 以獲得單因素試驗最佳值。 每次固定其中3 個因素， 變化另1 個因素。 因素變化范圍為超聲時間5 ～35 min， 超聲提取溫度30 ～80 ℃，樣品量0.05～0.30 g， 溶劑體積1～9 ml。

1.3.2 中心組合設計（CCD） 實驗 采用CCD 對單因素試驗選出的最佳條件進行進一步優化。

1.3.3 數據分析 利用Design-Expert.V8.0.6 軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲時間的選擇 準確稱取適量標準品（GBW08573 黃魚） 加入HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V）， 放入超聲浴中， 室溫下超聲5、 10、 15、 20、25、 30、 35 min， 以考察超聲時間對Cr 提取濃度的影響， 結果見圖1。 Cr 的提取濃度隨著超聲時間的增加而增大。 當超聲時間20 min 時， Cr 的提取濃度均接近最大值， 再增加超聲時間對Cr 提取濃度影響不大。 因此， 本實驗選擇超聲提取20 min。

2.1.2 超聲溫度的選擇 選擇超聲時間為20 min， 準確稱取適量標準品加入HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V）， 分別在30、 40、 50、 60、 70、 80 ℃溫度下超聲提取， 考察超聲溫度對Cr 提取濃度的影響， 結果見圖2。 Cr 的提取濃度均隨著超聲溫度的升高而增大， 當超聲溫度為70 ℃時， Cr 的提取濃度達到最大值。 因此， 本實驗選擇超聲溫度70 ℃。

2.1.3 樣品量的選擇 選擇超聲時間為20 min、超聲溫度為70 ℃下， 分別準確稱取0.05、 0.10、0.15、 0.20、 0.25、 0.30 g 的標準品加入HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V）， 考察樣品量對Cr 提取濃度的影響， 結果見圖3。 Cr 的提取濃度均隨著樣品量的增加而減小， 說明單位體積的溶劑對重金屬的提取量是有限的。 當樣品量多于0.15 g 時， Cr的提取濃度明顯減少。 因此， 本實驗選擇樣品量0.10 g。

2.1.4 溶劑體積的選擇 選擇超聲時間20 min、超聲溫度為70 ℃下， 準確稱取0.10 g 標準品分別加入1、 3、 5、 7、 9 ml 的HNO3-H2O2（2 ∶1， V／V）， 考察溶劑體積對Cr 提取濃度的影響， 結果見圖4。 Cr 的提取濃度均隨著溶劑體積的增大而增大， 但溶劑用量大會增加成本。 綜合考慮重金屬提取濃度和測定成本， 本實驗選擇溶劑體積為7 ml。

2.2 CCD 實驗及分析

2.2.1 回歸模型的建立 根據CCD 原理設計4 因素3 水平共30 組實驗， 因素和水平見表1， 實驗結果見表2， 方差分析結果見表3。 實驗數據回歸擬合得到回歸方程為： Cr 提取濃度＝＋0.38 ＋0.063A＋0.044B-0.031C＋0.00375D-0.006875AB-0.006875AC-0.005625AD-0.012BC-0.003125BD＋0.019CD-0.032A2-0.016B2-0.043C2-0.024D2（A 為超聲時間， B 為超聲溫度， C 為樣品量， D為溶劑體積）。 回歸模型的一次項A、 B 為極顯著（P＜0.01）， C 為顯著； 交互項CD 為顯著； 二次項A2和C2為極顯著， B2和D2為顯著。 并且二次回歸模型P＜0.01， 說明回歸方程關系為極顯著； 失擬項為0.3483＞0.05 表明失擬不顯著， 此方程擬合較為合理。 回歸模型的R-Squared ＝0.947 4，Adj R-Squared ＝0.898 4， 說明此模型與實際擬合程度較為相符， 用此模型分析和預測Cr 的超聲提取工藝合適。 Pred R-Squared ＝0.754 5， 與Adj R-Squared合理一致。 模型的信噪比Adeq Precision＝15.377＞4， 說明此模型具有足夠的信號以響應 此實驗設計。

圖1 超聲時間對Cr 提取濃度的影響

圖2 超聲溫度對Cr 提取濃度的影響

圖3 樣品量對Cr 提取濃度的影響

圖4 溶劑體積對Cr 提取濃度的影響

續表2

表3 CCD 方差分析

2.2.2 響應面分析 利用響應面分析確定4 個因素交互作用對Cr 提取濃度的影響。 兩兩因素交互作用的響應面圖見圖5 所示。 通過比較可見， C（樣品量） 與D （溶劑體積） 響應面坡度最為陡峭， 說明C 和D 兩因素交互作用顯著。 其它因素交互作用影響不顯著。 由軟件預測的最佳超聲提取條件為： 超聲時間29.79 min， 超聲溫度80 ℃，樣品量0.07 g， 溶劑體積6.28 ml， Cr 提取濃度理論值為0.45 mg／kg。 考慮實際操作條件， 適當修正超聲提取條件為： 超聲時間30 min， 超聲溫度80 ℃， 樣品量0.07 g， 溶劑體積6.50 ml， 驗證結果表明， Cr 濃度為0.41 mg／kg。 實驗值與預測值比較相符， 說明此模型可靠， 超聲輔助提取海魚中Cr 可行。

2.3 2 種消解方法的比較 分別采用超聲提取法和濕式消解法處理標準品， 取6 次平行的實驗結果。 濕式消解法測定結果為： Cr 濃度0.37 mg／kg，回收率為87.1%， 相對標準偏差 （RSD） 為5.6%。 超聲提取法測定結果為： Cr 濃度0.39mg／kg， 回收率為96.4%， 相對標準偏差（RSD） 為4.4%。 2 種方法的測定結果均與標準品參考值（0.43 mg／kg） 相符。

圖5 各因素交互作用的響應面圖

2.4 樣品的測定 取海魚樣品可食用部分， 流水沖洗， 去離子水清洗， 晾干， 搗碎混勻。 在選擇的最佳超聲提取條件下， 分別用超聲提取法和濕式消解法測定樣品中Cr 的含量。 濕式消解法測定結果為： 帶魚中Cr 為0.21 mg／kg， 黃花魚中Cr 為0.30 mg／kg。 超聲提取法測定結果為： 帶魚中Cr為0.19 mg／kg， 黃花魚中Cr 為0.23 mg／kg。 根據食品安全國家標準《食品中污染物限量》 （GB 2762-2017）［12］對水產動物及其制品中Cr 的限量標準為≤2.0 mg／kg， 所檢測的帶魚和黃花魚樣品中， Cr 的含量均未超過國家限量標準。

3 結論

本研究建立了超聲波輔助提取-原子吸收光譜法測定海魚樣品中Cr 的方法。 在選定的最佳條件下， 超聲提取法能夠定量提取樣品中的Cr。 與濕式消解法相比， 超聲提取法時間更短、 消解過程更溫和、 試劑消耗更少、 污染更小。