高效液相色譜法測定熏燒烤肉制品中 苯并（a）芘的不確定度評定

◎ 王璟秋

（安徽省食品藥品檢驗研究院食品檢驗所，安徽 合肥 230051）

熏燒烤肉制品是指以畜禽肉或其可食副產品等為主要原料，配以調味料（含食品添加劑），經腌（鹵）、煮等工序進行前處理，再以煙氣或蒸汽或火苗或其他熱介質進行熏烤或燒烤等工序制成的熟肉制品[1]，常見的有烤鴨、熏雞、煙熏火腿等。食物在熏制、烘烤過程中，蛋白質、脂肪、碳水化合物等在高溫條件下發生一系列裂解反應，再經過環化和聚合反應等產生以苯并（a）芘為代表的多環芳烴類物質[2]。苯并（a）芘是多環芳烴中具有代表性的毒性最大的一種強致癌物[3]，也是熏燒烤肉制品中最常檢出、毒性最強的物質[4]，其有很強的生物毒性和致癌性、致突變性及間接致畸性，是世界排名前三的致癌物質之一[5-6]。據流行病學調查，長期食用熏燒烤制食品與某些癌癥發病有一定關系，如冰島居民愛吃煙熏食品，被認為是造成其胃癌發生率高居世界第3 位的主要原因，日本居民愛吃炭火烤魚，也在一定程度上造成了其胃癌的高發生率[7]。

熏燒烤肉制品中苯并（a）芘含量是涉及食品安全的重要指標，我國《食品國家安全標準 食品中污染物限量》明確規定熏燒烤肉制品中苯并（a）芘不得超過5 μg·kg-1[8]，本文采用GB 5009.27—2016 中的方法[9]，利用高效液相色譜熒光法檢測熏燒烤肉制品中苯并（a）芘的含量，并依據JJF 1059.1—2012[10]對實驗過程中各因素產生的不確定度進行評定，找出影響較大的因素，建立一套合理完整的評定方案。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

LC-20AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）、AT100 梅特勒電子天平（精度0.1 mg，梅特勒-托利多公司）、GVA50A 氮吹儀（美國Organomation 公司）和苯并（a）芘分子印跡柱（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

正己烷、二氯甲烷、乙腈（色譜純）以及苯并（a）芘標準品（批號：GBW（E）080476，4.95 μg·mL-1，中國計量科學研究院）

1.2 樣品前處理

按照GB 5009.27—2016對熏燒烤肉制品中苯并（a）芘含量進行檢測：將肉制品試樣預處理后，稱取1.0 g（精確到0.001 g），加入正己烷，旋渦混合0.5 min，40 ℃下超聲提取10 min，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液再重復提取一次，合并上清液，轉移進已活化后的苯并（a）芘分子印跡柱，經淋洗、收集、氮吹后，準確吸取1 mL 乙腈渦旋復溶，過微孔濾膜供測定。

1.3 高效液相色譜分析條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse PAH，4.6 mm×250 mm×5 μm，柱溫：35 ℃；熒光檢測器：激發波長384 nm，發射波長406 nm；流動相比例：乙腈∶水（88 ∶12）；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。

1.4 標準溶液的配制

移液管準確移取2 mL 標準品（濃度4.95 μg·mL-1），置于10 mL 棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即成濃度為0.99 μg·mL-1的標準中間液。將標準中間液用乙腈逐級稀釋配制成濃度為1.98 ng·mL-1、3.96 ng·mL-1、7.92 ng·mL-1、9.90 ng·mL-1和19.80 ng·mL-1的標準工作溶液。

1.5 數學模型的建立

根據GB 5009.27—2016 的測定方法及結果計算，待測物苯并（a）芘的含量按公式（1）計算。

式（1）中，X-樣品中待測物苯并（a）芘的殘留量，單位為μg·kg-1；C-由標準曲線得到的樣品中苯并（a）芘濃度，單位為ng·mL-1；V-氮吹后最終定容體積，單位為mL，實驗中V=1 mL；m-待測樣品的稱樣量，單位為g；1 000-由ng·g-1換算成μg·kg-1的換算因子。

因實驗中產生的各種隨機因素會對測量結果有一定影響，故在測量模型中加入重復性系數frep，建立樣品中苯并（a）芘含量不確定度測量模型，即：

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據試驗過程和測量模型可看出，影響測定結果不確定度urel(X)的主要因素有：①由標準曲線得到的樣品中苯并（a）芘濃度引入的不確定度urel(C)。②氮吹后最終定容體積引入的不確定度urel(V)。③樣品稱量引入的不確定度urel(m)。④樣品前處理及儀器進樣的重復性引入的不確定度urel(frep)。⑤回收率產生的不確定度urel(R)。因此，試樣中苯并（a）芘的殘留量的相對標準不確定度urel(X)可由式（3）計算。

2.2 由標準曲線得到的樣品中苯并（a）芘濃度引入的不確定度urel(C)

該過程的不確定度由3 部分組成：①標準物質引入的不確定度urel(C1)。②制備標準曲線產生的不確定度urel(C2)。③標準曲線擬合過程產生的不確定度urel(C3)。

2.2.1 標準物質本身純度引入的不確定度urel(C1)

由供應商提供的標準品證書可知，苯并（a）芘標準品濃度為4.95 μg·mL-1，其相對擴展不確定度在k=2 情況下為2.5%，服從正態分布，則相對標準不確定度

2.2.2 制備標準曲線產生的不確定度urel(C2)

制備標準曲線產生的不確定度urel(C2)包括配制標準中間溶液引入的不確定度urel(C21)和制備標準工作液引入的不確定度urel(C22)。

（1）配制標準中間液引入的不確定度urel(C21)。苯并（a）芘標準品濃度為4.95 μg·mL-1，用2 mL 移液管移取標準品至10 mL 容量瓶并用乙腈定容，將其配制為0.99 μg·mL-1的中間液，配制過程中使用的移液管和容量瓶均會引入一定的不確定度，按照《常用玻璃量具檢定規程》（JJG 196—2006）給出的不同計量器具的允許差δ，按照正態分布計算，標準不確定度u=δ/，相對標準不確定度urel=u/V。

2 mL 移液管最大允許誤差為±12 μL，則移液管引入的相對標準不確定度為：

10 mL 容量瓶最大允許誤差為±0.02 mL，則容量瓶引入的相對標準不確定度為

因此，配制標準中間液引入的不確定度為：

（2）制備標準工作溶液引入的不確定度urel(C22)。分 別 取20 μL、40 μL、80 μL、100 μL 和200 μL 體積的標準中間液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，分別配制成濃度為1.98 ng·mL-1、3.96 ng·mL-1、7.92 ng·mL-1、9.9 ng·mL-1和19.8 ng·mL-1的標準工作溶液，配制過程中的移液器和10 mL 容量瓶均引入了一定量的不確定度。

①移液器引入的不確定度。測量過程中分別使用20 μL、100 μL 和200 μL 量程的移液器，20 μL 移液器吸取20 μL 時容量允許誤差±3.0%，100 μL 移液器吸取40 μL 時容量允許誤差±3.0%，100 μL 移液器吸取80 μL 時容量允許誤差±2.0%，100 μL 移液器吸取100 μL 時容量允許誤差±2.0%，200 μL 移液器吸取200 μL 時容量允許誤差±1.5%，按照均勻分布計算，則相對標準不確定度為：

②10 mL 容量瓶引入的不確定度。10 mL 容量瓶的相對標準不確定度計算方式同2.2.2 中（1），5 個10 mL 容量瓶引入的相對標準不確定度為：

故配制標準工作液引入的不確定度為：

則制備標準曲線產生的不確定度

2.2.3 標準曲線擬合過程引入的相對標準不確定度urel(C3)

分 別 測 定 濃 度 為1.98 ng·mL-1、3.96 ng·mL-1、7.92 ng·mL-1、9.90 ng·mL-1和19.80 ng·mL-1的標準工作溶液，每一濃度分別測定2 次。以上機標準工作液濃度Ci為橫坐標，以得到的對應峰面積Ai為縱坐標，擬合求得標準工作曲線方程，測得相關數據見表1。

表1 苯并（a）芘回歸直線測量結果表

樣品經過6 次平行測定后，通過擬合直線求出濃度C0，根據公式（1）計算出樣品中所含苯并（a）芘殘留量X0，按（4）式計算擬合曲線的標準不確定度u(C3)：

式中，Ai-標準工作溶液各點的待測物峰面積測定平均值；Ci-標準溶液的濃度值；b-擬合直線的斜率；a-擬合直線的截距；n-標準溶液測定次數，本實驗中n=5×2=10；p-樣品測試次數，本實驗中p=6；C0-由線性方程計算求得的待測物濃度平均值；

則擬合標準曲線導致的相對標準不確定度urel(C3)=u(C3)/C0，有關量值見表2。

表2 苯并（a）芘標準曲線擬合的不確定度計算的有關量值表

則待測物苯并（a）芘濃度引入的不確定度：

2.3 定容體積的相對標準不確定度urel(V)

凈化液氮吹近干后，用1 mL 移液管吸取1 mL 乙腈定容，1 mL 移液管移取溶劑，允許誤差為±6.0 μL，按均勻分布計算，則定容體積引入的相對標準不確定度為：

2.4 稱量樣品的相對標準不確定度urel(m)

稱量樣品的天平最大允許誤差為±5 mg，采用均勻分布，則稱量樣品的相對標準不確定度為：

2.5 實驗合成重復性的相對標準不確定度urel(frep)

按實驗方法平行測定樣品6 次，測得樣品待測物含量為X1～X6，見表3。計算待測物含量的平均值=2.708μg·kg-1，標準偏差S()=0.116 1，不確定度，則由實驗重復性引起的相對標準不確定度為

表3 待測物含量和重復性相對標準不確定度urel(frep)計算結果表

2.6 回收率產生的不確定度urel(R)

對空白樣品試樣中添加濃度水平3.0 μg·kg-1標準工作液，平行測定6 次，結果見表4。計算得：

平均回收率=87.6，標準偏差S(R)=1.216，不確定度u(R)=S(R)/=0.4 964，相對不確定度

表4 樣品添加回收率表

2.7 不確定度測定結果

苯并（a）芘的合成不確定度為：

取擴展因子k=2，置信概率p=95%，則擴展不確定度U=urel(X)×2×，故得到熏燒烤肉制品中苯并（a）芘的含量結果，詳見表5。

表5 熏燒烤肉制品中苯并（a）芘檢測結果表

3 結論

本實驗采用高效液相色譜法測定熏燒烤肉制品中的苯并（a）芘含量，并經過分析和比較各因素引入的不確定度大小來進行不確定度評定，通過試驗中各因素的不確定度來源和結果可知，標準曲線擬合過程引入的不確定度最大，其次是重復性測定，其他因素引入的不確定度相對較小。因此在標準溶液配制過程中應選擇精密度高的器具，定期維護并校準相關儀器設備，使其保持良好的工作狀態，規范操作，提高人員技能，減少人為誤差，以提高測定結果的可靠性和準確性。