分光光度法測定食品中亞硝酸鹽不確定度評估

◎ 陳銀珊

（廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東 廣州 510670）

在日常生活中，由亞硝酸鹽引發的食物中毒事件及誘發致癌的報道常見諸于報端[1]。亞硝酸鹽是一種比較常見的食品添加劑，在肉制品生產中被廣泛使用，如常被用于醬鹵肉、西式火腿、腌臘肉等肉制品中，可增加肉類的鮮度，使產品色澤更加誘人，還可抑制微生物的生長，由于亞硝酸鹽在肉制品生產中的無可替代性和功能性，導致肉制品中亞硝酸鹽的使用量超標現象時有發生[2-3]。而過量施用硝態氮肥的蔬菜[4-5]、酸菜等腌漬食品[6]、隔夜熟菜、霉變蔬菜、在不潔灶具中放置過久的食物以及火鍋食品中[7]，都含有較多的亞硝酸鹽。因此準確檢測食品中亞硝酸鹽的含量至關重要。

本文依據《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）第二法（分光光度法）檢測食品中亞硝酸鹽的含量，并依據《測量不確定度評定與表示》（JJF1059.1—2012），分析探討食品中亞硝酸鹽的檢測過程，對檢測過程中各個不確定度的來源進行分析評定，計算食品中亞硝酸鹽檢測結果的不確定度[8]。

1 檢測方法

1.1 檢驗依據

GB 5009.33—2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》第二法分光光度法。

1.2 實驗設備

ML204/02 電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、UV-2550紫外可見分光光度計（島津公司）。

1.3 實驗條件

樣品條件：樣品經充分粉碎后無異常現象；儀器條件：比色皿為1 cm，波長為538 nm；環境條件：溫度為（25±5）℃，濕度為60%～80%。

1.4 檢測原理

在樣品提取液中加入硼酸飽和溶液調節pH 值為弱酸性，之后加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液，使蛋白質沉淀，除去蛋白質和脂肪后，加入對氨基苯磺酸與亞硝酸鹽重氮化，與加入的鹽酸萘乙二胺偶合產生紫紅色，于波長538 nm 處測吸光度，利用外標法測得亞硝酸鹽的含量。

2 數學模型

樣品中的亞硝酸鹽含量按式（1）計算。

式（1）中，X1-待測試樣中亞硝酸鹽的含量，單位為mg·kg-1；m1-待測樣液中亞硝酸鹽的質量，單位為μg；M-樣品質量，單位為g；V1-測定用樣液體積，單位為mL；V0-樣品處理液總體積，單位為mL；1 000-轉換系數。

3 標準不確定度各不確定度的來源

根據實驗步驟分析，食品中亞硝酸鹽不確定度主要來源于：測量重復性、樣品稱量、樣品定容、測定用的樣液以及工作曲線。

4 標準不確定度分量的評定

4.1 測量重復性引入的不確定度

6 次重復測量的數據見表1。

表1 重復測量的數據表

單次測量的不確定度（mg·kg-1）計算為：

（ω為亞硝酸鹽單次測量值）

標準不確定度（mg·kg-1）計算為：

測量結果的相對不確定度計算為：

4.2 樣品稱量引入的不確定度

由天平的檢定證書可知，天平的擴展不確定度為U=0.2 mg，k=2，則樣品稱量的標準不確定度計算為：

則稱量5.000 0 g 樣品引入的相對標準不確定度計算為：

4.3 樣品定容引入的不確定度

4.3.1 由容量瓶校準引入的不確定度

由200 mL 容量瓶的檢定證書可知，容量瓶的擴展不確定度U=0.03 mL，k=2，則樣品定容至200 mL引入的相對標準不確定度計算為：

4.3.2 由溫度引入的不確定度

實驗是在20 ℃的溫度條件下進行的，實驗室的溫度波動為±5 ℃，20 ℃溫度下水的體積膨脹系數為2.07×10-3/℃，假定為均勻分布，則由溫度引入的不確定度計算為：

4.3.3 樣品定容引入的合成不確定度

樣品定容引入的合成不確定度計算為：

4.4 測定用樣液引入的不確定度

4.4.1 由移液器引入的不確定度

移取樣品液40 mL，即使用1 ～5 mL 移液器分8次移取，根據校準證書可知，移液器的擴展不確定度U=0.2%（5 mL），k=2，則吸取樣液體積引入的相對標準不確定度計算為：

4.4.2 比色管定容引入的不確定度

由50 mL 比色管校準證書可知，比色管的擴展不確定度U=0.08 mL，k=2，則由其引入的相對標準不確定度計算為：

4.4.3 測定用樣液引入的合成不確定度

實驗過程中溫度不變，由4.3.2 可知溫度引入的不確定度μT=0.006 0，則測定用樣液引入的合成不確定度計算為：

4.5 工作曲線引入的不確定度

4.5.1 配制亞硝酸鈉標準使用液引入的不確定度

（1）配制亞硝酸鈉標準溶液（200 μg·mL-1）引入的不確定度分為亞硝酸鹽標準物質引入的不確定度、稱量0.100 0 g 亞硝酸鈉標準物質引入的不確定度以及500 mL 容量瓶引入的不確定度。

亞硝酸鹽標準物質引入的不確定度，亞硝酸鈉標準物質的純度為99.99%±2.0%，假定為均勻分布，則由標準物質引入的不確定度計算為：

稱量0.100 0 g亞硝酸鈉標準物質引入的不確定度，稱量0.100 0 g 亞硝酸鈉標準物質的不確定度計算為：

500 mL 容量瓶引入的不確定度，已知U=0.20 mL，k=2，500 mL 容量瓶引入的不確定度計算為：

配制亞硝酸鈉標準溶液（200 μg·mL-1）的合成不確定度，實驗過程中溫度不變，由4.3.2 可知溫度引入的不確定度μT=0.006 0，則配制亞硝酸鈉標準溶液（200 μg·mL-1）的合成不確定度計算為：

（2）吸取2.5 mL 亞硝酸鈉標準溶液引入的不確定度。已知U=0.2%（2.5 mL），k=2，則吸取2.5 mL亞硝酸鈉標準溶液引入的不確定度計算為：

（3）100 mL容量瓶引入的不確定度。已知U=0.05 mL，k=2，則100 mL 容量瓶引入的不確定度計算為：

（4）配制亞硝酸鈉標準使用液（5.0 μg·mL-1）的合成不確定度。實驗過程中溫度不變，由4.3.2 可知溫度引入的不確定度μT=0.006 0，則配制亞硝酸鈉標準使用液（5.0 μg·mL-1）的合成不確定度計算為：

4.5.2 擬合工作曲線引入的不確定度

根據標準，測定標準曲線的9 個質量濃度點，每個質量濃度點測1 次，一共有9 個測試點。根據所得的數據繪制標準曲線為y=0.015 49x–0.000 58，R2=0.999 93。當x取值xi時，由回歸方程y=bx+a計算得到的y的估計值為yj，即yj=a+bxi，測量值yi與估計值yj的殘差反映了回歸方程的精密度。具體數據如表2 所示。

表2 亞硝酸鹽標準曲線結果表

回歸方程的剩余標準差計算為：

測定樣品液6 次，測得樣品液中亞硝酸鹽含量的平均值為x0=11.2 mg·kg-1，則標準曲線校準帶來的相對不確定度計算為：

4.5.3 紫外可見分光光度計產生的標準不確定度

由UV-2550 紫外可見分光光度計的檢定證書可知，透射比的擴展不確定度為Uts=0.3%，k=2，波長的擴展不確定度為Ubc=0.3 nm，k=2，用同一個波長測量，波長的不確定度可以不計入。則由紫外可見分光光度計產生的標準不確定度計算為：

4.5.4 由工作曲線引入的標準不確定度

由工作曲線引入的標準不確定度計算為：

4.6 合成不確定度

合成相對標準不確定度：

合成標準不確定度（mg·kg-1）：

擴展不確定度：

當k=2 時，則分光光度法測定食品中亞硝酸鹽的擴展不確定度（mg·kg-1）計算為：U=0.35×2=0.70。

5 結論

取包含因子為2，則食品中亞硝酸鹽含量的擴展不確定度為0.70，由本文中亞硝酸鹽的測定結果可知亞硝酸鹽的含量平均值為11.2 mg·kg-1，根據該實驗的評定，食品中亞硝酸鹽的測定結果可以表示為X=（11.2±0.70）mg·kg-1，k=2。