大蔥中凝集素的分離純化與鑒定

◎ 潘曉梅

（白銀市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 白銀 730900）

凝集素是指非免疫來(lái)源的糖結(jié)合蛋白，其具有凝集細(xì)胞和沉淀糖復(fù)合物以及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的能力。植物凝集素作為微生物與植物的共生介質(zhì)，可防止植物病原菌對(duì)植物造成危害。隨著研究的深入和發(fā)展，凝集素的藥物價(jià)值也體現(xiàn)的越來(lái)越明顯。同時(shí)，凝集素在抗動(dòng)植物病毒、防御真菌、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存和生物固氮等方面也有著重要的作用。近年來(lái)，隨著對(duì)凝集素研究的展開(kāi)，人們已經(jīng)越來(lái)越認(rèn)識(shí)到凝集素的重要性，其在免疫學(xué)、腫瘤、生殖生理和細(xì)胞生物學(xué)等許多方面都得到應(yīng)用，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)上呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。

大蔥具有大蒜素、果膠等多種物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、防癌及抗癌等生理作用，而對(duì)大蔥中植物凝集素的研究尚未開(kāi)展。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大蔥中的凝集素進(jìn)行分離純化和鑒定，為大蔥的生理活性研究提供理論基礎(chǔ)[1]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

MJ-176NR 高速組織搗碎機(jī)（松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社）、KDC-160H 冷凍離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司）、600型恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）、DEAE-52 離子交換柱（2.6 cm×40 cm，上海滬西分析儀器廠）、Biologic DuoFlow 中高壓柱層析系統(tǒng)（美國(guó)伯樂(lè)公司）、DYCP-12c 電泳儀（北京六一儀器廠）、Mini-PROTEAN 3 垂直平板電泳槽（美國(guó)伯樂(lè)公司）、100 μL 微量進(jìn)樣器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠）以及HI 2210 pH METER pH 計(jì)（意大利哈納儀器公司）。

1.2 材料與試劑

大蔥（產(chǎn)源地山東）、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、硫酸銨、鹽酸、95%乙醇、考馬斯亮藍(lán)G250、葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸、氨水，冰醋酸、甲醇、甘油、巰基乙醇、溴酚藍(lán)、甘氨酸、DEAE 纖維素（52）、十二烷基硫酸鈉（SDS，≥99.0%）及三羥甲基氨基甲烷（Tris，≥99.9%），所用試劑均為分析純。

生理鹽水；飽和硫酸銨溶液（pH7.0）；25 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液（Tris buffer saline，TBS）；磷酸緩沖鹽溶液（PBS，0.017 5 mol·L-1，pH6.7）1 000 mL；子交換層析所用試劑：磷酸緩沖液（pH7.4，0.15 mol·L-1），0.05 mol·L-1Tris-HCl 緩沖液；SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳試劑凝膠貯液；0.05 mol·L-1pH8.0 Tris-HCl緩沖液；分離膠緩沖液；電極緩沖液（3 g Tris、14.4 g甘氨酸、1 g SDS、ddH2O 定容至1 000 mL）；樣品緩沖液；過(guò)硫酸銨（AP）溶液；染色液；洗脫液；標(biāo)準(zhǔn)蛋白（次高分子量）；濃縮膠緩沖液；固定液；阿氏液（Alsevers，提前配制[2]）。

1.3 透析袋的處理

將透析袋剪成15 cm 長(zhǎng)度，先用50%乙醇浸泡20 min，去除表面的油脂類(lèi)物質(zhì)；再用0.01 mo1·L-1Na2CO3和0.01 mo1·L-1EDTA 煮沸30 min，去除表面的重金屬、鹽等雜質(zhì)。處理好的透析袋浸入蒸餾水中，保存在冰箱中備用。

1.4 DEAE 纖維素的活化處理

活化纖維素一般按樣品的蛋白質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算，是蛋白質(zhì)量的10 ～15 倍。取DEAE 纖維素1.5 g，溶解于0.1 mol·L-1NaOH 溶液中，浸泡過(guò)夜，盛裝于錐形瓶中；布氏漏斗上減壓過(guò)濾，蒸餾水重復(fù)清洗至pH8.0左右，抽干；用0.1 mol·L-1HCl 溶液浸泡30 min，用蒸餾水清洗至pH6.0 左右，抽干；BS（0.017 5 mol·L-1，pH6.7）浸泡3 h；傾去微細(xì)不沉降的懸浮顆粒，加入PBS（0.017 5 mol·L-1，pH6.7）使容積為沉淀體積的1.5 倍。

1.5 大蔥凝集素的分離純化

1.5.1 粗提取液制備

大蔥洗凈粉碎勻漿，取上清液，加入硫酸銨近約60%飽和度，4 ℃冷藏靜置過(guò)夜，5 000 r·min-1離心20 min 棄去上清液，取沉淀得到大蔥蛋白粗提取產(chǎn)物。將沉淀用Na2HPO4-Na2HPO4（pH7.4）緩沖液溶解后，離心去沉淀取上清液，用Na2HPO4-Na2HPO4（pH7.4）緩沖液透析除去硫酸銨，奈氏試劑檢驗(yàn)完全沒(méi)有硫酸銨時(shí)為透析終點(diǎn)。再用聚乙二醇進(jìn)行樣品濃縮至體積≤5 mL，準(zhǔn)備上樣層析。

1.5.2 DEAE-離子交換層析

取濃縮液上樣DEAE-52 作為固定相（1.5 cm×30 cm），活化后的層析柱用0.05 mol·L-1Tris-HCl（pH8.0）緩沖液平衡，用0 ～800 mmol·L-1Tris-HCl溶液進(jìn)行離子強(qiáng)度線性梯度洗脫，洗脫處理溫度25 ℃，流速為1 mL·min-1，用1.5 mL 離心管收集不同時(shí)間段內(nèi)流出的洗脫液，得到層析分離液，每管洗脫液對(duì)應(yīng)標(biāo)號(hào)，洗脫完成后-20 ℃保存。

1.5.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

清洗玻璃板，制備模具；按表1 配方分別配制分離膠和濃縮膠；在濃縮膠聚合完成后（30 min），拔梳子，沖洗加樣孔，把含膠的模具放入電泳槽中，加入電極液至沒(méi)過(guò)加樣孔；上樣量根據(jù)蛋白濃度確定，為20 μg總蛋白；電壓恒定在100 ～150 V；待溴酚藍(lán)快走到分離膠的底部，準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)移；將膠置于固定液中浸泡30 min 后將分離膠浸入染色液中染色30 min；取出分離膠，先用蒸餾水漂洗一次，浸入脫染液中脫染，室溫浸泡凝膠或37 ℃加熱使其脫色，更換脫色液，直至出現(xiàn)清晰的電泳帶為止；以各標(biāo)準(zhǔn)樣品遷移率做橫坐標(biāo)，分子量做縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 濃縮膠和分離膠的配方表

1.6 大蔥凝集素活性鑒定

自實(shí)驗(yàn)用白兔耳緣靜脈采集血液，血樣采集后立即與等體積的阿氏液混合，并用TBS 溶液（0.025 mol·L-1，含0.15 mol·L-1NaCl，pH7.5）潤(rùn)洗4 ～5 次，第1 次2 000 r·min-1離心3 min，第2 ～4 次3 000 r·min-1離心2 min，第5 次以3 000 r·min-1離心3 min，每次離心后小心棄去上清液，潤(rùn)洗后用TBS 配制成體積分?jǐn)?shù)為2%的兔血紅細(xì)胞懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在96 孔“V”型微量血凝板中進(jìn)行。先在每孔中加入25μL 的生理鹽水，再向每孔中加入層析后的蛋白洗脫液25μL，并在一個(gè)孔中加入25μL 的生理鹽水最為空白對(duì)照，將血球緩沖液依次加入每孔內(nèi)。輕微振蕩搖勻后靜置15 min 進(jìn)行觀察[3-5]。與生理鹽水的空白對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照，若有明顯差異的即為有凝集活性。同樣可觀察凝集的紅細(xì)胞邊緣的齊整程度，若有參差即為有凝集活性；若邊緣平整，則為紅細(xì)胞受重力作用自動(dòng)沉淀。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝集素的分離純化

由圖1 可見(jiàn)，大蔥提取液經(jīng)過(guò)層析，紫外分析得到4 個(gè)特征吸收峰，分別為5、15、28 和41 號(hào)收集管，即分離得到4 組活性物質(zhì)。

圖1 層析后蛋白質(zhì)在280 nm 處吸光值折線圖

2.2 凝集素相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，測(cè)出該凝集素在凝膠中有色帶，由圖2 可計(jì)算出蛋白質(zhì)的遷移率為49.2%，從標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量曲線求的凝集素的表觀分子質(zhì)量為41 kDa。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量對(duì)照見(jiàn)圖3，SDS 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4。

圖2 SDS-聚丙烯酰胺電泳凝膠圖

2.3 凝集素活性鑒定

在96 孔板中分別加入具有特征吸收的層析收集液，生理鹽水為空白對(duì)照組，同時(shí)用血漿凝固酶進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果如圖5 所示。左起第1 列為陽(yáng)性對(duì)照組，向右分別依次為5、15、28 和41 號(hào)收集液，空白對(duì)照組，血漿自然沉降組。

經(jīng)凝血活性檢測(cè)，對(duì)照空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果顯示，僅第4 個(gè)峰，即41 號(hào)管收集液具有較高的凝血活性。在觀察凝血活性時(shí)，看到紅細(xì)胞邊緣模糊不是十分清晰的即為有凝集效應(yīng)。邊緣較為平整的與空白對(duì)照相近，即沒(méi)有凝集活性。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量對(duì)照?qǐng)D

圖4 SDS 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖5 96 孔板凝血性實(shí)驗(yàn)圖

3 結(jié)論

食物中凝集素對(duì)抗癌藥物的治療作用有增益效果，同時(shí)也能提高癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性，因此凝集素被認(rèn)為是十分重要的活性成分[6]。凝集素是具有不同分子量，且由不同物質(zhì)分子組成的一類(lèi)物質(zhì)，具有極其豐富的多樣性，因而不同植物的凝集素各有不同，研究前景十分廣泛。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生化基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)操作對(duì)大蔥中凝集素進(jìn)行分離，通過(guò)凝血活性實(shí)驗(yàn)對(duì)分離物質(zhì)進(jìn)行鑒定，成功從大蔥中分離出有效的活性凝集素物質(zhì)。并通過(guò)電泳得到大蔥中凝集素的表觀分子質(zhì)量為41 kDa，為大蔥的食療與生物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值研究提供了參考。