羅俊霞,趙建波,王 俊
(1.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)流通中心,河南 鄭州 450006;2.鄭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,河南 鄭州 450008;3.鄭州市農(nóng)林科學(xué)研究所,河南 鄭州 450000)
君子蘭為石蒜科君子蘭屬多年生草本植物,中國(guó)普遍栽培的君子蘭(Clivia viaminiata)屬于君子蘭屬中大花君子蘭類和垂笑君子蘭類[1~2]。大花君子蘭和垂笑君子蘭原產(chǎn)于南非,于20世紀(jì)初經(jīng)德國(guó)和日本引入我國(guó)[2~3]。君子蘭的有性繁殖后代為高度雜合型,親本的優(yōu)良性狀不能通過雜交得到穩(wěn)定保存[4],用種子繁殖,實(shí)生苗容易產(chǎn)生變異且種苗生長(zhǎng)緩慢、植株后代分離嚴(yán)重,很難保持母株的優(yōu)良性狀[4~5];因此,在生產(chǎn)中,君子蘭一般采用分株法進(jìn)行繁殖,但是因母株萌芽少,特別是優(yōu)良品種產(chǎn)生的小芽更少,因此君子蘭繁殖速度慢,繁殖量少。為了探索出君子蘭快速繁殖的有效途徑,我國(guó)的廣大科技工作者在君子蘭的組織培養(yǎng)方面做了大量的有效的嘗試。據(jù)有文獻(xiàn)資料記載,我國(guó)的君子蘭組織培養(yǎng)的研究開始于20世紀(jì)80年代初期[2,7]。目前,我國(guó)君子蘭在組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)方面的研究已經(jīng)小有成就,因組織培養(yǎng)建立起來的快速繁殖技術(shù)在生產(chǎn)上得到較為廣泛的應(yīng)用。
外植體是植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段。植物營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官均可以作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。在我國(guó)君子蘭組織培養(yǎng)的研究中,早期以花蕾期的花絲、花藥、花瓣、花柄、花柱、花托、子房、子房壁居多[2,5,7],后來逐漸發(fā)展到用種子的胚、葉、莖、根、果實(shí)、果柄等作為組織培養(yǎng)的外植體[2,6,8~13]。
1.2.1 生殖器官作為組織培養(yǎng)外植體的培養(yǎng)效果 采用君子蘭的種子各部位為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得了不同的研究結(jié)論[2,6,9],采用君子蘭的種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)較其他外植體有利于誘導(dǎo)愈傷組織,“勝利”和“和尚”的種子離體培養(yǎng)過程中會(huì)直接形成叢生芽,增殖率較高[2],出愈率的高低和君子蘭的基因型有一定的關(guān)系[2];君子蘭成熟胚在組織培養(yǎng)中能產(chǎn)生分蘗株[6],而胚分化指數(shù)大于0.7的成熟胚在脫分化培養(yǎng)基上很難形成愈傷組織,并在激素的作用下形成畸形真葉,在不加任何激素的MS培養(yǎng)基上很快長(zhǎng)成可以分蘗的小苗[6];采用授粉后108 d的種子進(jìn)行播種,不能成苗,但用同齡幼胚培養(yǎng)則獲得了較高的發(fā)芽率,提早成苗的效果顯著[9],利用兩個(gè)品種的君子蘭的幼胚進(jìn)行組織培養(yǎng),兩個(gè)不同的品種獲得出愈率差異顯著,且均較低[12],造成幼胚出愈率差異的原因可能和品種有關(guān)系;另有些學(xué)者認(rèn)為君子蘭的組織培養(yǎng)以種子為外植體會(huì)出現(xiàn)廣泛的變異,優(yōu)良性狀消失[13~14]。
不同學(xué)者采用花器官的不同部位作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得了不同培養(yǎng)效果[3,5,7,14~24]。以花絲、花被筒、子房壁、胎座、胚珠、花柱為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)后均產(chǎn)生了愈傷組織,但用花藥、花瓣、花柄、花葶作外植體未能產(chǎn)生愈傷組織[3];子房、花絲、花托在不同的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)后有不同程度的愈傷組織產(chǎn)生[5];以君子蘭的花絲、花瓣、子房壁和胚珠在選用的不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一個(gè)月后,相繼出現(xiàn)愈傷組織[7],但用君子蘭的花藥為外植體進(jìn)行多次培養(yǎng),未能誘導(dǎo)出愈傷組織[7];花絲外植體的誘導(dǎo)與分化能力與花蕾發(fā)育時(shí)期有關(guān),花蕾長(zhǎng)度為0.6~1.0 cm時(shí),花絲的出愈率最高,在0.1~0.5 cm之間時(shí),花絲的出愈率較低,當(dāng)花蕾長(zhǎng)度大于1 cm時(shí),花絲外植體全部褐化死亡[14];在花絲離體培養(yǎng)中有類似體細(xì)胞胚的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生[14~15];取自同一花蕾的子房斷塊,培養(yǎng)在含有相同激素成份的培養(yǎng)基中,出愈率可以達(dá)到80%~90%[15];君子蘭幼嫩子房進(jìn)行誘導(dǎo)并篩選出0.2~1mm顆粒狀組成的及瘤狀結(jié)構(gòu)的胚性愈傷組織后,用無菌解剖刀切割成單細(xì)胞,可以在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上長(zhǎng)期淺層繼代培養(yǎng)[16];君子蘭幼花序子房在MS進(jìn)行誘導(dǎo)出愈率達(dá)到70%~80%,可以用分割愈傷組織塊的辦法在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)[17];分別以完整子房、胚珠+胎座、胚珠及對(duì)未授粉的子房進(jìn)行橫切后進(jìn)行接種,在不同的培養(yǎng)基上經(jīng)過不同的時(shí)間獲得不同的出愈率及不同的愈傷形態(tài),但是以胚珠連同胎座一起接種的方式出愈率最高,以胚珠為外植體進(jìn)行接種處理的出愈的時(shí)間較長(zhǎng)[18];在相同的條件下,不同品系的君子蘭幼子房進(jìn)行組織培養(yǎng)出愈率和分化率均存在較大差異,采用綠色花苞期的幼子房做外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)效果最好[19];君子蘭花器官離體培養(yǎng)過程中愈傷組織的誘導(dǎo)與分化均十分緩慢,在花瓣、花絲、胚珠3種外植體中,其出愈率和分化能力均不相同,花瓣外植體的出愈率和分化率最高[20],花瓣外植體的誘導(dǎo)與分化與花蕾的大小有關(guān)系,花蕾長(zhǎng)度為0.6~1.0 cm時(shí),花瓣的愈傷組織的出愈率和分化率最高,分別為15.6%、57.1%,其他長(zhǎng)度的花瓣外植體則基本褐化死亡[20];在頂芽、腋芽、莖、莖尖、子房壁、嫩葉、花柱、花絲、花瓣、花柄、胚珠、胎座等13種外植體中以子房壁的出愈率和繁華率為最高[21]。
以君子蘭果實(shí)器官為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究比較少,2011年袁麗偉等學(xué)者分別用“勝利”和“和尚”兩個(gè)品種的已經(jīng)成熟果實(shí)的子房壁和果柄為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng),結(jié)果以已經(jīng)成熟果實(shí)的子房壁為外植體分別獲得了40%、15%的出愈率,以果柄為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)沒有獲得愈傷組織[12];出愈率和君子蘭的基因型有關(guān)系[12]。
1.2.2 營(yíng)養(yǎng)器官作為組織培養(yǎng)外植體的培養(yǎng)效果 根、莖、葉器官的分生組織是組織培養(yǎng)中的常用外植體,早在20世紀(jì)80年代就有人利用君子蘭的莖尖、幼莖、莖切段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)成功獲得了愈傷組織[3,8];2000年,劉福平等學(xué)者用莖尖縱切塊、莖切塊為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)誘導(dǎo)出了愈傷組織[10];但利用君子蘭的莖切段為外植體的組織培養(yǎng)中,對(duì)莖采用不同的切法進(jìn)行比較,采用縱切兩刀和縱切兩刀并橫切一刀的莖上部這兩種外植體誘導(dǎo)出了芽和根[8];但取莖尖做外植體對(duì)君子蘭母體傷害較大[13];因?yàn)榫犹m的莖為短縮莖,在組織培養(yǎng)過程中取材難度大,且難以進(jìn)行消毒,接種后褐化嚴(yán)重[2-3],不宜作外植體[3,13],但夏萬由認(rèn)為采用君子蘭莖尖作為外植體可以去除病毒,解決因長(zhǎng)期無性繁殖導(dǎo)致病毒積累而引起的君子蘭品質(zhì)下降的問題[22]。
以君子蘭葉片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng),王永明等成功的獲得了愈傷組織[3,13,22-23];劉福平用幼葉基部橫切段和幼葉為外植體也誘導(dǎo)產(chǎn)生了愈傷組織[10],趙妮在君子蘭前期葉片組織培養(yǎng)中雖然誘導(dǎo)產(chǎn)生了少量的愈傷組織,但后期未能繼續(xù)分化[11];李淑華和劉敏分別用葉片和君子蘭幼葉作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng),沒有發(fā)現(xiàn)愈傷組織產(chǎn)生[5,7]。
以君子蘭根器官為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究較少[3,7,10],未見較為詳細(xì)的報(bào)道。王永明以幼根為外植體進(jìn)行培養(yǎng)研究,發(fā)現(xiàn)幼根的愈傷組織初期呈淡黃色或淡褐色,數(shù)月后轉(zhuǎn)成淡綠色致密的塊狀物[3];劉敏、劉福平分別用君子蘭的肉質(zhì)根和根切段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)均未能誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織[7,10]。
外植體的選擇與處理在其組織培養(yǎng)中有重要作用,但整體來講,為了保證組織培養(yǎng)的成功,無論是何種外植體都需要取其生理年齡較幼的器官及部位[22];因?yàn)橛啄甑慕M織較老年的組織有較強(qiáng)的形態(tài)發(fā)生能力。
在以種子為外植體的組織培養(yǎng)中,種子直接采自果實(shí)的種子,用70%的酒精10s+0.1%升汞8 min進(jìn)行消毒是最佳的種子消毒方法[2];在果實(shí)、果柄、幼胚為外植體的組織培養(yǎng)中,外植體用70%的酒精3 min+無菌水沖洗3次+0.1%升汞3 min+無菌水沖洗3~5次均獲得了較低的污染率[12];在以花器官(花瓣)為外植體的組織培養(yǎng)中,用0.1%升汞10 min消毒對(duì)降低花器官(花瓣)接種污染有一定的效果[20]。
各文獻(xiàn)在君子蘭組織培養(yǎng)中所使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比及培養(yǎng)效果。
基本培養(yǎng)基是君子蘭外植體離體生長(zhǎng)、發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)源,主要由基本培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組成[4]。君子蘭組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基均是在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加有機(jī)物、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而形成的,目前用于君子蘭組織培養(yǎng)試驗(yàn)的基本培養(yǎng)基有MS、N6、B5、Miller、White、ER、SH、農(nóng)試培養(yǎng)基等,其中用基本培養(yǎng)基MS進(jìn)行君子蘭組織培養(yǎng)嘗試的且成功的較多[2~3,20],以MS、N6、B5為基本培養(yǎng)基添加相同比例植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑成份進(jìn)行幼嫩子房段塊的組織培養(yǎng)時(shí)以MS基本培養(yǎng)基的出愈率最高,大于90%,N6、B5基本培養(yǎng)基的出愈率在80%~90%之間,但后者不能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織,而在MS添加相同比例植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中可以誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織[15];在MS、B5、White、ER、SH5種基本培養(yǎng)基中,只有MS和SH培養(yǎng)基可以獲得不定芽,B5和ER不適應(yīng)于君子蘭的組織培養(yǎng),White在誘導(dǎo)方面作用不明顯,但有益于壯苗和生根,誘導(dǎo)以MS為最好[24]。
由表1可知,在各學(xué)者在君子蘭的組織培養(yǎng)中采用了不同的外植體,對(duì)相同外植體采用了不同的取用方法,同時(shí)由于每一個(gè)試驗(yàn)中所采用的培養(yǎng)條件稍有差別、所使用的外植體的母株的生長(zhǎng)勢(shì)千差萬別,所以即使使用相同的外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)各學(xué)者在基本培養(yǎng)基中所添加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或者其比例也稍有差別,但在組織培養(yǎng)時(shí)添加6-BA、NAA、2,4-D植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的居多,另有在6-BA、NAA、2,4-D 基礎(chǔ)上添加一定比例的ZT、KT、IBA、IAA、LH的,不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比經(jīng)過不同組織培養(yǎng)時(shí)間后取得了不同的培養(yǎng)效果;獲得的愈傷組織經(jīng)過相同或者不同的培養(yǎng)基進(jìn)一步誘導(dǎo)有些愈傷組織可以分化成苗,如幼嫩子房既可以在MS+KT2.0+2,4-D1.0+3%蔗糖培養(yǎng)基上、莖尖、莖切塊、葉基部切段在MS+6-BA2.0+NAA2.0+2,4-D1.0培養(yǎng)基上、葉中上部的橫切段在MS+6-BA5.0+NAA0.5+2,4-D1.0上既誘導(dǎo)出愈傷組織,其愈傷組織也可以在同樣的培養(yǎng)基上分化成苗[10,13-15,20],只是相同的外植體在同一種培養(yǎng)基上的出愈率和所產(chǎn)生的愈傷組織的分化率有差別,也就是說改變植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和比例可以改變組織培養(yǎng)愈傷組織的出愈率或者分化率;也有研究報(bào)道愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基不相同,也就是愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基只能誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生、分化培養(yǎng)基只能誘導(dǎo)愈傷組織分化成苗,如用幼子房為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA1.0+NAA1.0+2,4-D2.0+35 g·L-1蔗糖+酸水解酪素0.4 g·L-1,其愈傷組織分化成苗的最佳培養(yǎng)基是MS+NAA0.5+KT3.0+35 g·L-1蔗糖[19];花絲、花被筒、子房壁、胎座、胚珠、花柱、幼根、莖尖、幼莖、胚在MS+6-BA0—1+NAA0—5+2,4-D0-3+30-80 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生愈傷組織,但愈傷組織不能分化,胚、幼莖、幼葉、莖尖、幼根的愈傷組織在MS+6-BA0.1+NAA0.05+2,4-D0.5-2+25-40 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基上可以分化成苗[3]。

表1 各文獻(xiàn)中推薦的最佳君子蘭組織培養(yǎng)中所使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比及培養(yǎng)效果
君子蘭組織培養(yǎng)中的生根培養(yǎng)基見表2。

表2 各文獻(xiàn)中君子蘭組織培養(yǎng)中的生根培養(yǎng)基及培養(yǎng)效果
由表2知,君子蘭組織培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基均是以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加適量的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、蔗糖、瓊脂粉及活性炭形成的,1/2MS無機(jī)鹽+MS有機(jī)物+6-BA0.5+IBA0.2+IAA0.6和MS+IAA0.2+NAA0.4+KT0.1之間前者比后者生根率高,但兩者較單用MS不加任何植物激素的培養(yǎng)基優(yōu)[5];王力超用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑將幼胚處理后接種在IBA0.1、IBA0.5+活性炭3g·L-1、IBA1.0+活性炭3 g·L-1等三種培養(yǎng)基上,幼胚的發(fā)芽率升高,因此在生根培養(yǎng)基中加入1.0 mg·L-1的KT和0.5 mg·L-1的NAA對(duì)幼胚發(fā)芽最有利[9];將愈傷組織接種在1/2MS+NAA0.2+KT0.1+2%蔗糖和1/2MS+IBA1.0+BA0.2+2%蔗糖兩種生根培養(yǎng)基中,其生根速度相同[10];在生根壯苗培養(yǎng)基中可以加適量的活性炭促進(jìn)生根[9;16];誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽一部分可以在分化培養(yǎng)基中生根,不能在分化培養(yǎng)基中生根的轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中2個(gè)月后多數(shù)生根,在1/2MS+20或35g·L-1蔗糖+5g·L-1瓊脂粉和1/2MS+NAA0.25或0.5+KT0.25或0.5+20g·L-1蔗糖+5g·L-1瓊脂粉兩種生根壯苗培養(yǎng)基中,其生根率大致相當(dāng),改變蔗糖、NAA及KT的濃度,對(duì)其生根率的改變不大,其生根率在76.4%~100%之間[19];細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值低時(shí)有利于生根,MS+6-BA1.0+ NAA0.1+4%蔗糖+0.4%瓊脂為適宜的生根培養(yǎng)基[22]。
由表1和表2可知,在君子蘭的組織培養(yǎng)中不僅引入了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,還引入了瓊脂、蔗糖、活性炭、水解蛋白乳、酸水解酪素等其他成份。瓊脂是選用優(yōu)質(zhì)天然石花菜、江蘺菜、紫菜等海藻為原料,采用科學(xué)方法精煉提純的天然高分子多糖物質(zhì),它和蔗糖的添加主要是給培養(yǎng)基中注入了更多的能量和有機(jī)物,誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中適宜的蔗糖濃度是3%[20],但在生根培養(yǎng)基中加入相同濃度的蔗糖,不同品系的君子蘭子房外植體愈傷組織的生根率稍有差別[19];活性炭的加入對(duì)君子蘭葉片和花絲外植體的誘導(dǎo)和分化產(chǎn)生很大的影響,不利于外植體的分化[13~14],但活性炭適合添加在君子蘭的生根培養(yǎng)基中[9,16];水解蛋白乳和酸水解酪素是多種氨基酸的混合物,它們的添加可以提供君子蘭組織培養(yǎng)全面的營(yíng)養(yǎng)元素,但容易引起污染[4];隨著酸水解酪素質(zhì)量濃度的增加,外植體的出愈率有所升高,達(dá)到400mg·L-1時(shí)出愈率最高,當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到600mg·L-1時(shí)出愈率轉(zhuǎn)為降低同時(shí)大部分愈傷組織呈現(xiàn)玻璃化狀態(tài)[19]。
在4℃的條件下對(duì)花絲、葉片、子房進(jìn)行低溫預(yù)處理,隨著預(yù)處理天數(shù)的增加,外植體的出愈率和分化率均減低,未經(jīng)過預(yù)處理的外植體的出愈率和分化率均為最高,低溫預(yù)處理的天數(shù)分別和出愈率、分化率呈反相關(guān)[13~14;19];同時(shí),隨著預(yù)處理天數(shù)的增加,外植體的污染率升高,低溫預(yù)處理的天數(shù)和污染率呈正相關(guān)[19]。
在組織培養(yǎng)的過程中,將接種后的外植體進(jìn)行暗培養(yǎng),隨著暗培養(yǎng)的天數(shù)的增加,外植體的出愈率和分化率均減低,未經(jīng)過暗培養(yǎng)的外植體的出愈率和分化率均為最高,暗培養(yǎng)的天數(shù)和出愈率、分化率呈負(fù)相關(guān)[13~14]。
在500~2 000 lx范圍內(nèi),隨著光照強(qiáng)度的增加,外植體的出愈率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),光照強(qiáng)度同出愈率呈負(fù)相關(guān)。就子房外植體的出愈率來講,最佳的光照強(qiáng)度是2 000 lx[19]。
君子蘭的組織培養(yǎng)中褐變是阻斷培養(yǎng)的一大阻礙[11],在組織培養(yǎng)過程中不良的培養(yǎng)條件也會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)褐化、老化、玻璃化的現(xiàn)象[12,14,19],因此,在君子蘭的組織培養(yǎng)過程中應(yīng)該盡可能的延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間[12],改變培養(yǎng)條件,調(diào)整培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的比例來防止褐變的發(fā)生[11-12,14,19],提高君子蘭組織培養(yǎng)的出愈率和分化成苗的能力。另外,君子蘭外植體生長(zhǎng)分化緩慢,也是君子蘭組織培養(yǎng)應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)中的制約因素,在君子蘭經(jīng)過組織培養(yǎng)成苗的過程中有些可以一次成苗,大部分要經(jīng)歷兩個(gè)步驟:一是誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織,二是胚性愈傷組織先形成芽,然后芽伸長(zhǎng)后在其基部長(zhǎng)出根形成小植株[15],因此,在生產(chǎn)中利用有限的材料獲取盡可能多的外植體材料并促進(jìn)其愈傷組織有效分化才能提高君子蘭組織培養(yǎng)的效率,擴(kuò)大君子蘭組織培養(yǎng)在其商業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。