利用秸稈制備生化富里酸應用研究

黃明慧，張倩茹，韓夢琪，高希龍，李 華，羅 星

（中國農業大學煙臺研究院，山東煙臺264670）

目前，中國農作物秸稈綜合利用率較低［1］，人們對小麥秸稈大多采取的是焚燒處理方式［2］，不僅易引發火災，而且污染環境、浪費資源。花生是中國重要的油料作物之一［3］，花生秸稈產量較大，僅山東省就達489萬t。因其營養豐富，常被用來作為牲畜的飼料。風干的花生秸稈硬度大，木質化程度高，適口性差，飼料化利用率較低［4］。花生紅衣為花生深加工后的副產物，可入藥，含豐富的多酚類物質，抗氧化活性強，可作為天然抗氧化劑［5］，對多種出血癥也有較好的治療效果［6］。其含有的原花青素，具有降血壓、降血糖和抗過敏的作用。中國花生紅衣產量約18萬t/年，除了少量用于制藥外，大部分成為固體廢棄物［7］。

植物源生化富里酸（Biotechnology fulvic acid，BFA），是利用微生物發酵技術從植物源中制取的一種生物發酵產物。這種富里酸含礦物質、氨基酸、核酸、內源激素［8］等生物活性物質，能提高植物體內的多種酶活性，促進新陳代謝及農作物生長發育，是一種良好的植物生長調節劑［9］，可提高作物產量及改善品質［10］，增強作物抗逆性［11］，對農業生產方面大有益處。中國農業科學院研究得出，在施用相同化肥量的條件下，增施秸稈源富里酸肥料可顯著提高作物產量［12］。富里酸具有較高的比表面積和螯合能力，能與金屬離子、農藥和多種有機物結合形成螯合物，影響土壤基質中有毒物質的滯留和釋放狀況［13］。劉厶瑤等［14］采用土壤培養試驗研究了富里酸對土壤中污染水平較高的DNBP降解的動力學過程，表明適宜濃度的富里酸對DNBP的降解效果最佳。徐燦燦等［15］研究了富里酸與葉面硒肥同時作用時，可對低汞污染的油菜農田土壤有修復功能。Samavat等［16］研究了腐植酸物質對黃楊枯萎病的影響，表明腐植酸物質對病害有一定的防治效果。

以花生秸稈、小麥秸稈、花生紅衣為原料，采用發酵法生產富里酸，研究不同原料的富里酸對植物生長的影響。嘗試利用農作物秸稈通過微生物發酵制備生化富里酸，探索秸稈高附加值利用的新途徑，期望服務于農業生產。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：花生秸稈、小麥秸稈采自中國農業大學煙臺研究院實驗基地；花生紅衣取自山東威海臨港區秀榮花生專業合作社；小麥種子（京冬22號）購置于煙臺市芝罘區種子公司。

儀器：PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；WMK-08恒溫培養箱，山東濰坊醫療器械廠；HWY-100B恒溫培養搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；旋轉蒸發儀，德國海道爾夫公司。

藥品：重鉻酸鉀、濃硫酸、硫酸亞鐵、鄰菲羅琳、氫氧化鈉、焦磷酸鈉均為分析純，去離子水為實驗室自制。

1.2 方法

1.2.1 生化富里酸制備小麥秸稈、花生秸稈、花生紅衣干燥后粉碎，過40目篩，密封4℃貯存。取500 g小麥秸稈、花生紅衣、花生秸稈和混合秸稈（小麥秸稈∶花生秸稈∶花生紅衣=2∶2∶1）放入發酵桶中，加入20 g紅糖、30 g玉米淀粉、5 g尿素、5 mL菌液，用去離子水調節含水率為60%～65%，放入培養箱中35℃發酵7 d。發酵后的物料按質量比1∶3加去離子水，攪拌均勻，擠壓提取富里酸粗液。富里酸粗液中加入5 mL發酵菌，25℃曝氣發酵72 h后，用焦磷酸鈉與氫氧化鈉的混合溶液調節發酵液至pH 8～10，靜置1 h后過濾得到生化富里酸精制液［17］，利用旋轉蒸發儀濃縮得到生化富里酸濃縮液。

1.2.2 富里酸含量測定采用重鉻酸鉀滴定法，稱取試樣于錐形瓶中，加入適量去離子水，于瓶口插上小玻璃漏斗，置于沸水浴中加熱溶解，期間攪動多次。30 min后取出錐形瓶，待冷卻至室溫后，將溶液及殘渣全部轉入容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，過濾，棄去最初的部分濾液。準確吸取濾液于錐形瓶中，加入5 mL重鉻酸鉀溶液，緩慢加入濃硫酸15 mL，于沸水浴中加熱氧化。30 min后將錐形瓶取出，冷卻至室溫，加入適量去離子水、2～3滴鄰菲羅琳指示劑，用硫酸亞鐵標準溶液滴定，溶液由橙色經綠色轉變為磚紅色為終點［18］。

按下式計算出生化富里酸產率。

式中，V0表示滴定空白管所消耗的硫酸亞鐵銨體積；V表示滴定樣品管所消耗的硫酸亞鐵銨體積；N表示硫酸亞鐵銨標準溶液的濃度；0.003為碳的毫克當量；a表示樣品溶液滴定的體積；b表示測定時所吸取的樣品溶液的體積；G表示配制樣品溶液時所加入的樣品干重；C表示富里酸的含碳比（取0.5）。

1.2.3 發芽趨勢生化富里酸濃縮液稀釋20、15、12、10倍，去離子水為空白對照。將小麥種子用去離子水沖洗干凈，放入鋪有雙層濾紙的培養皿中，每組放100粒，每個處理設3次重復。分別向培養皿中加入預先配制的不同種類、不同稀釋倍數的富里酸溶液至種子高度的1/3～1/2，帶孔保鮮膜覆蓋，25℃恒溫箱中培養144 h，觀察發芽情況。胚根長度大于等于種子長度，胚芽長度大于等于種子長度的50%時認定為發芽［19］。

式中，Gt為在t日的發芽數；T為種子總數。

1.2.4 胚根測量每個培養皿中選取長勢均一、健康的小麥幼苗30株，測其胚根長度，取平均值。

1.3 數據處理

利用Excel 2013軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同發酵原料對生化富里酸產率的影響

用小麥秸稈、花生秸稈、花生紅衣、混合秸稈發酵制備生化富里酸，采用容量法檢測生化富里酸產率，結果見表1。由表1可知，發酵小麥秸稈和混合秸稈均具有較高的生化富里酸產率，其中，混合秸稈產率最高，達7.44%，較發酵花生紅衣高2.87個百分點。表明小麥、花生秸稈的纖維素、半纖維素易降解，花生紅衣降解較慢；但適當比例混合后發酵可充分發揮三者的協同作用，從而提高生化富里酸的產率。

表1 原料對富里酸發酵制備的影響

2.2 生化富里酸對發芽趨勢的影響

用制備的生化富里酸稀釋液（以花生秸稈源為例）進行小麥種子發芽趨勢研究，以去離子水為空白對照。144 h發芽率變化如圖1所示。24～96 h發芽程度隨時間的延長而增加，96 h達最大；96～144 h發芽率變化不大。相對于空白對照，生化富里酸能明顯提高種子的發芽率，在96 h生化富里酸提升發芽率15.00個百分點。表明生化富里酸中含對植物生長有促進作用的酶類、氨基酸、維生素和微量元素等生物活性物質［20］。

2.3 生化富里酸濃度對發芽率的影響

取自制生化富里酸溶液（以花生秸稈源為例）（4.92 g/L）分別稀釋10、12、15、20倍，以去離子水為空白對照進行發芽率研究，結果如圖2所示。與空白對照相比，生化富里酸稀釋15、20倍能促進種子發芽，生化富里酸稀釋10、12倍時抑制種子發芽，其中，稀釋15倍時效果最好，能提升種子發芽率15.00個百分點。

圖2 生化富里酸濃度對發芽率的影響

2.4 不同發酵原料生產的生化富里酸對發芽率的影響

利用小麥秸稈、花生紅衣、花生秸稈和混合秸稈為原料發酵，制備出4種不同的生化富里酸，在相同稀釋濃度下（稀釋15倍），以去離子水為空白對照進行發芽率試驗，結果如圖3所示。與空白對照相比，4種生化富里酸均能提高種子發芽率，但提高程度不同。其中，花生秸稈源生化富里酸效果最好，發芽率提升23.00個百分點；花生紅衣、小麥秸稈、混合秸稈源生化富里酸發芽率分別提升15.00、7.00、10.00個百分點。表明花生秸稈發酵產生的生化富里酸具有較高的生物活性。

圖3 不同源生化富里酸溶液對種子發芽率的影響

2.5 不同源生化富里酸對種子胚根長度的影響

取小麥秸稈、花生紅衣、花生秸稈和混合秸稈為原料生產的生化富里酸稀釋液，處理小麥種子96 h，以去離子水為空白對照，選取各培養皿中長勢均一、健康的幼苗30株，測其胚根長度，結果如表2所示。不同源的生化富里酸稀釋液對種子胚根長度的影響趨勢與其對發芽率的影響趨勢相近，均明顯促進種子胚根伸長。花生秸稈源生化富里酸稀釋液對胚根長度促進作用最大，根長達39.4 mm，相比CK增加7.1%。小麥秸稈源生化富里酸稀釋液促進作用不明顯。

表2 不同源生化富里酸稀釋液對種子胚根長度的影響

3 小結

利用小麥秸稈、花生紅衣、花生秸稈、混合秸稈發酵制備生化富里酸，研究不同稀釋倍數的生化富里酸溶液對小麥種子發芽率的影響及不同源生化富里酸的生理活性，得出主要結論如下。

1）不同原料制備生化富里酸的產率不同。混合原料（小麥秸稈∶花生秸稈∶花生紅衣=2∶2∶1）具有較高產率，達7.44%，小麥秸稈生化富里酸產率為6.79%。

2）不同稀釋倍數的生化富里酸對種子萌發的影響不同。高濃度的生化富里酸溶液對種子發芽有抑制作用，低濃度有促進作用。其中，生化富里酸溶液（4.92 g/L）稀釋15倍具有較好的生理活性。

3）不同原料源生化富里酸生理活性有一定差異。其中，花生秸稈源生化富里酸溶液生理活性最佳，可明顯提高種子發芽率及促進胚根伸長，對植物生長有一定的促進作用。