Nrf2在糖尿病血管并發癥中的研究進展

金海群，王艷菁，朱忠欣

近年來，糖尿病（diabetes mellitus，DM）已成為威脅人類健康的全球性疾病之一。糖尿病相關的代謝異常會逐漸引起微血管及大血管并發癥，血管并發癥的出現及發病是患病率及病死率增加的主要原因。大量研究表明：糖脂代謝紊亂、血小板的高度激活、內皮功能障礙、炎癥、氧化應激等都可能導致糖尿病血管并發癥。目前，較為被認可的觀點是：糖尿病血管并發癥發病的重要環節是高血糖狀態下的過度氧化應激[1]。因此如何使用抗氧化應激的手段對糖尿病血管疾病進行預防和治療或找到潛在的靶點是當前的研究熱點之一[2]。核因子紅細胞 2 相關因子 2（Nrf2）是機體維持氧化還原穩態的一種轉錄因子，在調控各種抗氧化蛋白的基礎表達和誘導表達方面發揮著重要的作用[3]。本文將重點綜述 Nrf2 對糖尿病血管并發癥的影響和保護機制，以及其作為糖尿病血管并發癥防治潛在靶點的可能性。

1 糖尿病血管并發癥發生的氧化應激機制

許多研究表明，過度的氧化應激是糖尿病患者心血管疾病的一個重要危險因素[4]。正常生理狀態下，機體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產生和消除處于動態平衡狀態，糖尿病患者由于血糖代謝障礙使機體長期處于高糖狀態，當細胞處于高糖狀態下時，細胞對葡萄糖的氧化作用增強，經過糖酵解途徑代謝生成丙酮酸，再經過三羧酸循環提供過多的遞氫體（NADH 和 FADH2）給線粒體電子傳遞鏈。當超過電子傳遞鏈的處理能力時，線粒體內 ROS 的產量增加，通過損傷線粒體、胰島素抵抗、腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RASS）激活等機制使 ROS 進一步增加導致動態平衡被破壞，機體抗氧化的防御能力下降。ROS 誘導NF-κB 蛋白的激活，進一步促進炎性細胞因子 TNF-α、IL-6等的釋放，使血管生理穩態失衡，導致內皮細胞受損和內皮功能障礙，引發多種血管病理過程最終使得一系列心血管事件的發生[5-6]。糖尿病患者細胞內 ROS 的增加是血管并發癥發生的開端，已知血管功能與代謝需求之間的主要聯系紐帶為內皮細胞，一氧化氮（NO）是內皮細胞保護因子，有助于內皮細胞生理功能的發揮，機體內源性產生 NO 的方式主要是通過一氧化氮合酶亞型神經元 NOS（NOS1）、誘導型 NOS（NOS2）和內皮 NOS（NOS3）催化相應底物[7]。其中，內皮一氧化氮合酶（eNOS）的底物主要是 L-精氨酸。然而在病理狀態下，eNOS 不產生 NO，而是促進活性氮基團（RNS），過氧亞硝酸鹽（ONOO-）等超氧化物的生成，降低了 NO 生物利用率，血管保護作用明顯降低，組織器官受損風險增加，產生聯級效應引起糖尿病血管并發癥的進一步發展[8-9]。可見，氧化應激與糖尿病血管并發癥的病理情況息息相關。因此，目前認為抗氧化藥物在糖尿病血管并發癥預防和治療中具有極大的潛力，但是，據報道，對患者使用外源性抗氧化劑如維生素 E 并不能有效改善病情。于是，近年來越來越多的研究聚焦于內源性抗氧劑機制的探索，迄今為止，眾多內源性抗氧化物質如：Nrf2、過氧化物酶（Prxs）、超氧化歧化酶（SOD）、谷胱甘肽抗氧化酶（GSH-Px）等已被發現，對其結構和機制的研究也在不斷深入，其中具有調節細胞內各種抗氧化防御因子表達和活性能力的 Nrf2 在維持機體氧化還原平衡中被認為具有關鍵的作用[10]。

2 Nrf2/Keap1/ARE 信號通路概述

2.1 Nrf2

Nrf2/Keap1/ARE 信號通路是人類機體復雜的內源性防御機制中抵抗氧化應激和外來物質脅迫的主要途徑之一，在轉錄、翻譯、翻譯后修飾、轉錄因子的核易位及其與 ARE 驅動的基因啟動子的結合水平上發生變化來起到保護作用[11]。Nrf2 蛋白分子量為 100 kD，廣泛存在于多個組織器官中，在代謝器官如肝臟、腎臟和持續暴露在外界環境的器官如皮膚、消化道等高度表達。Nrf2 是 CNC 轉錄因子家族中的一員。人類 Nrf2 是具有 605 個氨基酸的蛋白質，由 7 個獨特的域組成，也稱為 Nrf2-ECH 同源（Neh）域，每個域生物學功能的產生既相互獨立又相互聯系，是 Nrf2 發揮作用的基礎[11-13]。作為氧化應激的關鍵調節因子之一，Nrf2 主要通過改變其信號通路的傳導在細胞中發揮抗氧化的生物效應。

2.2 Keap1

細胞骨架相關的肌動蛋白 Kelch-like ECH-相關蛋白 1（Keap1）具有 624 個氨基酸，是 Nrf2 的負調控蛋白，通過磷酸化、泛素化以及核穿梭機制來調控 Nrf2 的活性，產生不同的功能[12-13]。人類 Keap1 蛋白主要包括 5 個主要的功能結構區域，分別是：①N 端區域（N-terminal region，NTR）；②BTB 區域（broad complex,Tramtrack and Bric-a-Brac，BTB），是一個蛋白質-蛋白質相互作用的結構域，與 Keap1 自身形成蛋白二聚體有關，參與 Nrf2 的泛素化降解；③干預區（intervening region，IVR），連接 BTB與 DGR 區域，此區域富含半胱氨酸殘基，是 Keap1 與自由基發生反應的場所，當受到外源性或內源性刺激時 IVR區構象發生變化導致 Keap1 和 Nrf2 復合體解離；④雙糖重復序列重要的中間區域結構域（double glycine repeat，DGR 區）干預 Keap1 與 Nrf2 的 Neh2 域結合；⑤C 端區域（C-terminal region，CTR）。因此，Keap1 在 Nrf2 信號通路中扮演重要角色[13]。

2.3 Nrf2-ARE 信號通路

抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）是一特異的 DNA 啟動子結合序列，能與超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽 S-轉移酶（GST）等具有細胞保護作用的蛋白質和代謝酶的基因啟動子序列相結合。在正常生理狀態下，細胞氧化-還原水平處于動態平衡狀態，Nrf2 主要以非活性的狀態儲存于細胞質中，與其抑制蛋白 Keap1 結合形成絡合物，后者與肌動蛋白結合而被錨定在胞漿中，然后通過泛素介導的蛋白質降解系統降解，使相關保護酶和抗氧化物質處于基礎表達水平。當機體過度氧化應激時受到ROS 的刺激，會改變 Keap1 蛋白中半胱氨酸殘基的結構，并且 Nrf2 被磷酸化，導致 Keap1/Nrf2 復合體在細胞質中發生解離。游離狀態的 Nrf2 不會被機體蛋白酶體系統降解，并會促使 Nrf2 從細胞質進入細胞核，在細胞核內，Nrf2 上高度保守的 bZIP 區結構和其專性伴侶——肌腱膜纖維肉瘤蛋白（musculoaponeurotic fibrosarcoma protein，Maf）結合成異源二聚體后，識別并結合抗氧化反應元件ARE，進而啟動受 ARE 調控的下游保護基因的轉錄，編碼下游多種抗氧化應激酶，如：過氧化氫酶（CAT）、血紅素加氧酶（HO-1）、醌氧化還原酶-1（NQO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）等的表達而發揮細胞保護作用。在機體恢復氧化-還原平衡后，Nrf2 從 ARE 序列中脫落，被轉運回胞漿中降解，機體內 Nrf2 重新維持在較低水平，通過上述效應維持細胞體內穩態，發揮廣泛的細胞保護作用[14]。這一路徑被稱為對抗氧化應激的中心通路——Nrf2/Keapl/ARE 信號通路[14-16]。

3 Nrf2 與血管并發癥的聯系

3.1 糖尿病血管并發癥的類型

糖尿病患者病死率增高與血管并發癥息息相關，大血管并發癥、微血管并發癥和糖尿病心肌病變是血管并發癥主要的三種類型[17-18]。大血管病變主要包括：動脈粥樣硬化、腦血管病變（引起腦溢血和腦梗死的主要原因）、外周血管病和冠狀動脈疾病等。而糖尿病腎病、神經病變、皮膚微血管病變、視網膜血管病等都屬于微血管病變。這些血管并發癥主要是糖尿病病理情況下機體高血糖、血脂異常、蛋白質代謝紊亂、有毒代謝產物相互作用的結果。此外，已有研究表明氧化應激是糖尿病血管并發癥病理的一部分，并通過炎癥、纖維化等途徑產生對血管的損害因素[19-20]。目前，已證實高糖或糖尿病病理狀態下可導致 ROS 水平的升高，而升高的 ROS 可通過經典通路激活 Nrf2，進而提高機體抗氧化功能。

3.2 Nrf2 與糖尿病血管并發癥的聯系

糖尿病是人類健康面臨的嚴峻挑戰之一。糖尿病患者發生心血管疾病的幾率遠大于普通人。在糖代謝紊亂情況下，血管平滑肌細胞和內皮細胞對高葡萄糖的敏感性遠高于正常水平。從而誘導產生大量活性氧化物破壞氧化還原平衡，使活性氧化物如 ROS、RNS 等在內皮細胞內積聚，而內皮細胞保護因子一氧化氮（NO）含量減少，引起內皮細胞線粒體功能缺陷，抗氧化能力驟減等一系列不利因素，導致內皮功能障礙和血管重塑。內皮功能的失調往往與血管并發癥的發展有關[21]。Nrf2 是重要的抗氧化應激因子，細胞內的抗氧化劑、排毒酶和許多其他蛋白質是 Nrf2 的下游靶標，同時醌氧化還原酶（NQO1）、谷胱甘肽 S-轉移酶（GST）、血紅素加氧酶-1（HO-1）和 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γGCS）等響應氧化應激的酶類都受到 Nrf2 的調控，因此 Nrf2 對于排解異源物質中和 ROS、促進細胞存活和維持細胞氧化還原穩態具有重要的意義（圖1）。目前，越來越多的學者聚焦于 Nrf2 對糖尿病血管并發癥作用的研究。

圖1 Nrf2 與糖尿病血管并發癥關系圖

在心肌病方面，糖尿病心肌病是嚴重的糖尿病血管并發癥之一。在糖尿病病理情況下，氧化應激、炎癥反應、代謝紊亂有可能造成血管內皮細胞損傷或功能失調，使微血管收縮異常，毛細血管密度降低，血循環受阻等，這進一步導致毛細血管基底膜增厚、心肌纖維化，最終發展成為糖尿病心肌病，而 Nrf2 在心肌病發生發展中扮演重要角色。有臨床研究發現糖尿病患者冠狀動脈舒張功能受損，血流儲存減少[22]。木犀草素在糖尿病心肌病的研究表明，對糖尿病心肌病小鼠模型使用木犀草素可顯著降低心肌細胞的氧化應激和炎癥反應，對心臟組織具有保護作用。進一步的研究發現激活 Nrf2 信號通路和抑制核因子-κB（NF-κB）通路是其主要原理[23]。Jiang 等[24]的研究結果表明，Nrf2 激活劑環丙柔比星 D（CVB-D）通過 Nrf2 相關的抗氧化途徑，激活其下游信號靶點：醌氧化還原酶 1（NQO-1）和過氧化物酶 1（Prdx1），以減弱氧化應激的作用在糖尿病心肌病的大鼠模型中產生治療效應。Gu 等[25]發現 Nrf2-KO 小鼠的心臟氧化應激、心臟結構變化及其功能失調比對照小鼠更為嚴重，對兩組模型使用蘿卜硫素（SFN，一種 Nrf2 的激活劑）干預治療的實驗中證實對照組中核 Nrf2 的含量以及Nrf2 下游基因 NQO1 和 HO-1的轉錄表達增加，而在Nrf2-KO 小鼠中，并未出現此現象。實驗最終得出 SFN 在1 型和 2 型糖尿病動物模型中均通過上調 Nrf2 來預防糖尿病性心肌病。因此，Nrf2 具有成為糖尿病心肌病治療靶點的潛力[26]。

在微血管方面，糖尿病視網膜病是常見的糖尿病微血管并發癥，前期研究發現糖尿病性視網膜病的發病機制是多方面的，涉及氧化應激、促炎性變化和晚期糖基化終產物的產生，隨著研究的深入發現糖尿病性視網膜病的主要病原之一是氧化應激。Liu 等[27]的研究表明糖尿病視網膜細胞中ROS 水平高于正常，而上調糖尿病視網膜細胞 Nrf2 的表達后 ROS 含量顯著下降，有效緩解視網膜神經元病變，顯示了 Nrf2 預防和治療糖尿病視網膜病的可能。糖尿病腎病（DN）也是主要的糖尿病微血管并發癥之一，其特征是連續的病理變化，當機體處于持續的高糖狀態下時會產生大量的 ROS，過多的 ROS 降低了內源性抗氧化物質的含量，進而導致機體防御能力的減退，同時 ROS 也能積蓄于腎實質細胞中，使細胞外基質蛋白合成增加，降解減少，導致間質纖維化，腎小球和腎小管基底膜和系膜基質增多增厚，促進了糖尿病腎病的發展最終將導致腎功能的缺失。糖尿病腎病患者的腎小球處于氧化應激狀態，在動物研究中，Nrf2 已經被證明在改善鏈脲佐菌素（STZ）引起的腎臟損害中至關重要。目前大量的學術研究表明 Nrf2 在預防糖尿病血管疾病中的重要作用，例如 SFN 激活 Nrf2 來抑制高血糖誘導ROS 的大量產生和緩解人微血管內皮細胞的功能失調[28]。Jiang 等[29]研究發現相比于 Nrf2+/+，Nrf2-/-小鼠受到 STZ誘導的糖尿病的腎損傷更為嚴重，證實了 Nrf2 在小鼠腎病模型中具有保護效應。據報道表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對糖尿病性腎病有作用。Sun 等[30]通過 STZ 將C57BL/6 野生型（WT）和 Nrf2-KO 小鼠誘發為糖尿病模型，使用 EGCG 進行 24 周的干預治療，研究發現在 WT小鼠中，EGCG 激活 Nrf2 的表達，炎癥、氧化和纖維化指標明顯下降，而在 Nrf2-KO 小鼠中 EGCG 并不具有明顯作用。進一步的研究發現 EGCG 可能是通過 Keap1/Nrf2信號通路發揮治療作用。此研究首次證明了 Nrf2 在EGCG防御 DN 中起著至關重要的作用，也顯示了 Nrf2 對糖尿病血管并發癥的潛在治療意義。

動脈粥樣硬化是大血管病變的典型表現，臨床研究結果顯示出糖尿病的幾種病理狀況與動脈粥樣硬化的發病具有密切的聯系，提高了糖尿病患者動脈粥樣硬化發生的風險[31]。對動脈粥樣硬化發病原因進行研究，發現在泡沫細胞形成，脂質穩態調節，氧化還原調節和炎癥等多種病理生理過程中都有 Nrf2 的參與[32]。Tan 等[33]對糖尿病大血管和腎臟損傷老鼠模型使用 Nrf2 激動劑巴多索隆甲基（dh404）的類似物，結果表明 dh404 在較低劑量下，可明顯減輕糖尿病相關的動脈粥樣硬化，并減少血管組織氧化應激和促炎介質 TNF-α，細胞內黏附分子-1，進一步的體外研究發現dh404 能夠顯著上調 Nrf2 反應基因（谷胱甘肽 S 轉移酶、醌氧化還原酶 1 和血紅素加氧酶-1）。Xie 等[34]發現硫化氫誘導 Keap1 硫酸化且糖尿病促進的動脈粥樣硬化在 Nrf2激活時受到抑制。實驗表明氧化應激誘導黏附分子（如VCAM-1 和 ICAM-1）的表達，從而促進炎癥細胞在發展中的動脈粥樣硬化病變內募集和積累。而 H2S 能夠降低糖尿病小鼠血管中超氧化物、VCAM-1 和 ICAM-1 的水平并激活 Nrf2 和相關的抗氧化蛋白的表達，但對于 Nrf2 敲除的小鼠模型 H2S 不能很好地發揮其保護作用。由于脂代謝的紊亂，巨噬細胞中膽固醇和膽固醇酯的積累及泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化發生的關鍵因素，實驗在高血糖高血脂的條件下建立了具有體內巨噬細胞相關特征的體外巨噬細胞模型，發現 H2S 也能活化小鼠巨噬細胞中的 Nrf2，減少泡沫細胞的形成和超氧化物、過氧化物的產生，從而抑制糖尿病加速的動脈粥樣硬化。通過這些研究，我們可以認為上調 Nrf2 途徑可能是機體提高抗氧化能力和防治糖尿病大血管并發癥的新靶點。

血管內皮細胞具有參與血管重構、維持血管內環境穩態、調節血管的收縮舒張和對抗血栓等作用。內皮功能障礙（ED）是糖尿病血管并發癥發展中的關鍵事件，而研究表明高糖誘導的氧化應激在引起和加速 ED 中起關鍵作用。血管收縮力增強，氧化應激和血管炎癥反應加劇，NO 有效利用率下降等是 ED 的主要表現[35]。Xue 等[28]使用 Nrf2 的激活劑 SFN 對高血糖下內皮細胞生化功能障礙進行研究，實驗在低和高葡萄糖濃度（分別為 5 mmol/L和 30 mmol/L）中孵育人微血管 HMEC-1 內皮細胞，并通過核易位對 Nrf2 激活水平進行評估，檢測活性氧、甲基乙二醛、蛋白激酶 C 途徑、己糖胺途徑等的生物化學功能，結果顯示 SFN 能夠激活 Nrf2，促進 Nrf2 的核易位，ARE 相關基因谷胱甘肽還原酶、核轉酮醇酶的表達增加了3～5 倍，阻止高血糖引起的 ROS 增加，防止高血糖誘導的 PKC 途徑和己糖胺途徑的激活。最終得出結論：Nrf2 的激活可以預防由高血糖引起的內皮細胞的生化功能障礙和相關的功能性反應，Nrf2 連鎖基因在對抗高血糖引起的內皮功能障礙中的作用提示了可能的干預機制和潛在的治療靶點。據 Karan 等[36]的研究，糖尿病引起的 ED 能被 Nrf2的激活劑有效改善，認為 Nrf2/Keap1/ARE 網絡能夠提供開發維持細胞氧化還原環境療法的新思路。迄今為止，已有實驗證明 Nrf2 的幾種激活因子可以對抗糖尿病引起的 ED，如：蘿卜硫素、姜黃素等。其主要作用機制為激活 Nrf2 的信號網絡，增加 Nrf2 的核移位和積累，增強 HO-1 和NQO-1 的表達來減少細胞損傷，減弱細胞外基質（ECM）蛋白和促纖維化介質的誘導能力，降低 ROS 含量，從而降低炎癥反應、氧化損傷、組織纖維化和促進內皮細胞功能的恢復。

4 問題與展望

綜上所述，Nrf2 通路通過緩解氧化應激對糖尿病血管并發癥發揮一定的保護作用。近年來，已有大量實驗研究表明，Nrf2 信號通路在減輕高糖產生的自由基對機體的損傷方面具有良好作用；也有靶向激活 Nrf2 的藥物在細胞和動物實驗中取得較好的進展。然而，確切的 Nrf2 與氧化應激的聯系以及有助于糖尿病的血管并發癥的確切機制還是未知的，目前也未有充足的臨床證據證實 Nrf2 的激活劑在臨床上起到切實有效的作用，并且對于 Nrf2/ARE 通路在糖尿病發病機制中的變化還有待進一步的研究。總體來說，Nrf2 通路是目前發現的體內重要的抗氧化應激通路，在現有的基礎上，深入對 Nrf2 的研究，全面分析 Nrf2 信號網絡維持血管穩態的機制，結合早期糖尿病診斷有助于找到預防和治療糖尿病血管并發癥的新方法，最終提高糖尿病患者的生活質量和壽命。