槐耳對人急性T淋巴細胞白血病CEM-C1細胞耐藥性的逆轉作用及機制

任丹薇，龍思利，覃祥，牛亞娜，鐘芳芳，劉靜，劉文君

西南醫科大學附屬醫院兒科血液腫瘤病區/四川省出生缺陷臨床醫學研究中心，四川瀘州 646000

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是兒童最常見的惡性腫瘤，約占15歲以下兒童確診總數的25%，且近年來ALL的發病率逐年升高[1-3]。文獻報道，T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)的無事件生存率(event-free survival，EFS)明顯低于B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)，且T-ALL誘導失敗、復發、早期死亡的風險高于B-ALL[4]。歐美國家T-ALL患兒的5年EFS(5-EFS)為65.7%～83.8%，我國為40.2%～66.0%，預后較差[5-6]。 耐藥及復發是ALL治療失敗的主要原因，也是阻礙ALL患兒長期存活的瓶頸[7]。其中，糖皮質激素(glucocorticoid，GC)耐藥是導致兒童ALL治療失敗的主要原因之一[8]。兒童ALL初治病例中，約有20%的患兒對GC產生原發性耐藥；而復發病例中，GC耐藥率高達70%[9-10]。因此，尋找ALL耐藥相關基因并制定克服ALL耐藥的方案，已成為ALL臨床研究的熱點。

槐耳清膏是槐耳菌質的初提物，其主要活性成分是由6種單糖與18種氨基酸結合形成的多糖蛋白，具有調節免疫、抗腫瘤、抗病毒等作用[11-14]。另有研究發現，槐耳可逆轉多種腫瘤的耐藥性[15-17]， 但目前尚無槐耳逆轉ALL耐藥的相關報道。莫羅尼鼠白血病病毒前病毒整合位點(provirus integrating site moloney murine leukemia virus，Pim)家族基因包括Pim1、Pim2及Pim3，編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶，可整合到細胞信號網絡中，并調節多種細胞行為，如細胞增殖、存活及遷移等，與腫瘤的發生發展密切相關[18-19]。Pim3是新近發現且研究較少的一個Pim亞型，與胰腺癌等多種腫瘤耐藥相關，可能參與了腫瘤耐藥性的形成過程[20-21]。本研究以GC耐藥細胞株CEM-C1及GC敏感細胞株CEM-C7為研究對象，探討槐耳能否逆轉ALL細胞對GC的耐藥性及其可能機制，旨在探索改善ALL對GC耐藥的新方法，為優化兒童ALL治療方案及改善患兒預后提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人ALL細胞株CEM-C1、CEM-C7由四川大學華西第二醫院馬志貴教授饋贈。槐耳購自中國江蘇啟東蓋天力藥業有限公司；地塞米松(dexamethasone，DEX)購自國藥集團容生制藥有限公司；RPMI 1640培養液購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自中國杭州四季青公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；青霉素及鏈霉素雙抗、總RNA提取試劑盒、CCK-8及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗購自上海碧云天公司；反轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購自日本ToYoBo公司；GAPDH、Pim3引物購自上海生工生物工程股份有限公司；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；兔抗人GAPDH一抗購自美國Proteintech公司；兔抗人多藥耐藥基因1(MDR1)、Pim3單克隆抗體一抗購自英國CST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組 將CEM-C1、CEM-C7細胞懸浮于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及0.1 mg/ml鏈霉素雙抗的完全培養基中，并接種于培養瓶，置于37 ℃、含5%CO2、飽和濕度的培養箱中連續培養，每2 d更換1次培養液并傳代，取對數生長期的細胞進行后續實驗。CEM-C1、CEM-C7細胞經不同濃度(0、100、200、400、600、800 μg/ml) 槐耳處理24、48、72 h后，根據CCK-8實驗確定48 h為干預時間，200、600 μg/ml槐耳為后續實驗的干預濃度，100 μg/ml槐耳作為聯合用藥濃度與不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg/ml)DEX聯合作用于CEM-C1細胞。

1.2.2 CCK-8檢測細胞的增殖抑制率 收集對數生長期的CEM-C1、CEM-C7細胞，調整細胞密度為2×105個/ml，轉移90 μl細胞懸液至96孔板中，每孔加入10 μl預設濃度的各組藥物，使槐耳終濃度為50、100、200、400、600、800 μg/ml，DEX終濃度為12.5、25、50、100、200 μg/ml，以及100 μg/ml槐耳聯合不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg/ml)DEX，同時設置對照組(僅含培養基及細胞)及空白組(僅含培養基)，每組設4個復孔，放入CO2培養箱內培養24、48、72 h后，每孔再加10 μl CCK-8溶液，放入CO2培養箱內孵育4 h，用酶標儀在450 nm處測定各孔的光密度(OD)值。實驗獨立重復4次。細胞增殖抑制率(%)=1－[(OD實驗組－OD藥物對照)/(OD對照組－ OD空白組)]×100%。采用GraphPad Prism7軟件計算半數抑制濃度(IC50)。耐藥逆轉倍數=耐藥株的IC50/加藥處理耐藥株的IC50。兩藥相互作用指數(coefficient of drug interaction，CDI)=AB/(A×B)，其中AB為OD聯合組/OD對照組，A、B分別為兩種藥物的OD單藥組/OD對照組。若CDI＜1，兩藥為協同作用，值越小協同作用越強；CDI=1，兩藥為相加作用；CDI＞1，兩藥為拮抗作用，值越大拮抗作用越強[22]。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 取對數生長期的CEM-C1、CEM-C7細胞，經不同濃度(0、200、600 μg/ml)槐耳處理48 h后，用冷PBS洗滌2次，加入1×結合緩沖液重懸細胞，調整細胞密度為3×106個/ml，取100 μl細胞懸液于5 ml Falcon試管中，加入5 μl FITC Annexin V及5 μl PI，室溫避光染色15 min，然后加入300 μl結合緩沖液混勻，在1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗獨立重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期 取對數生長期的CEM-C1、CEM-C7細胞，經不同濃度(0、200、600 μg/ml)槐耳處理48 h后，用冷PBS洗2次，調整細胞密度為1×106個/ml，取1 ml單細胞懸液，棄上清，用70%的冷乙醇500 μl懸浮細胞，4 ℃過夜固定；PBS洗滌后加入500 μl預先配制的PI/RNase A工作液混勻，室溫、避光放置30～60 min，流式細胞儀檢測488 nm波長處的紅色熒光。實驗獨立重復3次。

1.2.5 Western blotting檢測細胞MDR1、Pim3蛋白的表達水平 收集細胞，設置CEM-C1、CEM-C7細胞組及C E M-C 1 細胞經不同濃度(0、2 0 0、600 μg/ml)槐耳處理組，按照全蛋白提取試劑盒說明書提取細胞全蛋白。BCA法測蛋白濃度，根據蛋白濃度取等量蛋白，加5×SDS上樣緩沖液煮沸5 min，進行SDS-PAGE電泳后將蛋白轉移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉1 h，經PBST充分洗滌10 min×3次，MDR1、Pim3單克隆抗體均按1:1000稀釋。4 ℃孵育過夜，充分洗滌后加山羊抗兔二抗，按1:2000稀釋，室溫孵育1 h，化學發光顯影。采用Image J軟件分析圖像，以MDR1、Pim3蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。實驗獨立重復3次。

1.2.6 qRT-PCR檢測細胞中Pim3 mRNA的表達水平 收集細胞，設置CEM-C1、CEM-C7細胞組及CEM-C1細胞經不同濃度(0、200、600 μg/ml) 槐耳處理組，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉錄為cDNA，熒光定量PCR法擴增目的基因及內參基因GAPDH。Pim3引物：正向5'-ACCGACTT CGACGGCAC-3'，反向5'-TATCGTAGAGAAGCACG CCC-3'；GAPDH引物：正向5'-ATGCTGGCGCT GAGTACGTC-3'，反向5'-GGTCATGAGTCCTTCCA CGATA-3'。qRT-PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。采用公式2-ΔΔCt計算目的基因mRNA的相對表達水平。均設3個復孔，實驗獨立重復3次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 槐耳對ALL細胞增殖的影響 CCK-8檢測結果顯示，用槐耳對CEM-C1及CEM-C7細胞處理24 h及72 h，100、200、400、600、800 μg/ml槐耳組的增殖抑制率明顯高于50 μg/ml槐耳組；槐耳處理48 h，細胞增殖抑制率呈劑量依賴方式增加，差異有統計學意義(P＜0.05，圖1)。根據結果選用200、600 μg/ml槐耳作為本實驗的干預濃度，100 μg/ml 槐耳作為聯合用藥濃度。槐耳處理CE M-C 1 及CEM-C7細胞24、48、72 h后，CEM-C1細胞的IC50分別為2272.0、313.4、1275.0 μg/ml，CEM-C7細胞的IC50分別為1406.0、757.5、1653.0 μg/ml，表明槐耳處理48 h對CEM-C1及CEM-C7細胞增殖的抑制作用最強，因此后續實驗選擇48 h作為干預時間。

2.2 槐耳對CEM-C1細胞耐藥性的逆轉作用 CCK-8檢測結果顯示，不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg/ml)DEX單獨作用于兩種細胞48 h后，CEM-C1細胞的IC50為98.89 μg/ml，CEM-C7細胞的IC50為0.16 μg/ml，依據公式計算CEM-C1細胞的耐藥倍數是CEM-C7細胞的618.06倍，符合兩種細胞的特性。槐耳(100 μg/ml)+DEX處理CEM-C1細胞后的IC50為73.75 μg/ml，耐藥逆轉倍數為1.34倍，差異有統計學意義(P＜0.05)；而聯合用藥對CEM-C7細胞無明顯影響。與單用DEX各組比較，100 μg/ml 槐耳聯合低濃度(12.5、25、50 μg/ml)DEX提高了CEM-C1細胞的增殖抑制率，差異有統計學意義(P＜0.05，表1)；各濃度DEX聯用槐耳的CDI均＜1，表明兩藥具有協同作用。

圖1 槐耳對CEM-C1及CEM-C7細胞增殖的影響(n=4)Fig.1 Effect of Huaier on the proliferation of CEM-C1 and CEM-C7 cells (n=4)

2.3 槐耳對CEM-C1、CEM-C7細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，隨著槐耳濃度的增加，CEM-C1及CEM-C7細胞的凋亡率逐漸增高，與對照組(0 μg/ml槐耳)比較差異有統計學意義(P＜0.05，表2)。

表1 DEX+槐耳對CEM-C1細胞增殖抑制率的影響(±s，n=4)Tab.1 Effect of DEX+Huaier on the inhibition ratio to CEM-C1 cells proliferation (±s, n=4)

表1 DEX+槐耳對CEM-C1細胞增殖抑制率的影響(±s，n=4)Tab.1 Effect of DEX+Huaier on the inhibition ratio to CEM-C1 cells proliferation (±s, n=4)

CDI. 兩藥相互作用指數

DEX濃度(μg/ml) 細胞增殖抑制率(%) CDI t/Z P DEX組 100 μg/ml槐耳+DEX組12.5 10.020±0.783 20.820±2.224 0.847±0.108 -9.163 0.001 25 13.850±1.302 25.140±3.352 0.817±0.121 -6.282 0.004 50 23.160±5.649 32.240±2.353 0.816±0.120 -2.968 0.025 100 48.410±6.810 58.280±4.428 0.768±0.240 -2.429 0.051 200 74.000±2.593 77.190±0.553 0.794±0.190 -2.406 0.088

表2 不同濃度槐耳對CEM-C1及CEM-C7細胞凋亡率的影響(%，±s，n=3)Tab.2 Effect of different concentrations of Huaier on the apoptosis of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

表2 不同濃度槐耳對CEM-C1及CEM-C7細胞凋亡率的影響(%，±s，n=3)Tab.2 Effect of different concentrations of Huaier on the apoptosis of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

與0 μg/ml槐耳組比較，(1)P＜0.05；與200 μg/ml槐耳組比較，(2)P＜0.05。

槐耳濃度 CEM-C1細胞凋亡率 CEM-C7細胞凋亡率0 μg/ml 9.937±0.966 7.810±0.850 200 μg/ml 27.780±0.528(1) 26.643±1.310(1)600 μg/ml 35.577±1.258(1)(2) 34.820±0.697(1)(2)F 556.401 590.162 P＜0.001 ＜0.001

2.4 不同濃度槐耳對CEM-C1細胞周期的影響 流式細胞術檢測結果顯示，200、600 μg/ml槐耳處理CEM-C1、CEM-C7細胞48 h后，S期細胞比例比對照組增高，G0/G1期細胞比例比對照組降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，各組細胞的G2/M期比例差異無統計學意義(P＞0.05，表3)。

2.5 CEM-C1、CEM-C7細胞中及槐耳處理后CEM-C1細胞中MDR1、Pim3蛋白表達水平比較 Western blotting檢測結果顯示，CEM-C1細胞中MDR1蛋白表達水平(2.41±0.32)明顯高于CEM-C7細胞(1.34±0.43)，差異有統計學意義(t=3.45，P＜0.05，圖2A)。CEM-C1細胞經200、600 μg/ml槐耳處理后，MDR1蛋白表達水平均低于0 μg/ml槐耳組(1.62±0.03、1.34±0.16 vs. 1.92±0.10)，差異有統計學意義(P＜0.05，圖2B)。CEM-C7細胞中Pim3蛋白表達水平(0.13±0.05)明顯低于低于CEM-C1細胞(0.39±0.10)，差異有統計學意義(t=3.94，P＜0.05，圖2C)。CEM-C1細胞經200、600 μg/ml槐耳處理后，Pim3蛋白表達水平均低于0 μg/ml槐耳組(1.05±0.14、0.75±0.13 vs. 1.48±0.33)，差異有統計學意義(P＜0.05，圖2D)。

2.6 CEM-C1、CEM-C7細胞中及槐耳處理后CEM-C1細胞中Pim3 mRNA表達水平的比較 qRTPCR結果顯示，CEM-C7細胞的Pim3 mRNA相對表達水平低于CEM-C1細胞(0.37±0.02 vs. 1.00)，差異有統計學意義(t=58.88，P＜0.05，圖3A)；與0 μg/ml槐耳組(1.00)比較，200、600 μg/ml槐耳組CEM-C1細胞中Pim3 mRNA的表達水平均明顯降低(分別為0.79±0.12、0.59±0.10)，且600 μg/ml槐耳組明顯低于200 μg/ml槐耳組，差異有統計學意義(P＜0.05，圖3B)。

表3 不同濃度槐耳對CEM-C1及CEM-C7細胞周期的影響(%，±s，n=3)Tab.3 Effects of different concentrations of Huaier on the cell cycle of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

表3 不同濃度槐耳對CEM-C1及CEM-C7細胞周期的影響(%，±s，n=3)Tab.3 Effects of different concentrations of Huaier on the cell cycle of CEM-C1 and CEM-C7 cells (%,±s, n=3)

與0 μg/ml槐耳組比較，(1)P＜0.05。

槐耳濃度(μg/ml) CEM-C1細胞周期 CEM-C7細胞周期S G2/M G0/G1 S G2/M G0/G1 0 34.807±1.305 9.967±0.112 55.227±1.416 37.823 ±6.362 8.483±1.292 53.693±7.547 200 39.363±0.785(1) 12.790±1.523 47.847±1.250(1) 61.010 ±1.715(1) 6.010±0.306 32.977±1.486(1)600 44.253±2.975(1) 7.663±1.438 48.083±1.857(1) 41.617 ±1.364(1) 10.680 ±0.528 47.553±0.970(1)F 17.985 13.481 22.567 30.752 5.725 16.955 P 0.028 0.059 0.001 ＜0.001 0.068 0.003

圖2 各組細胞中MDR1、Pim3蛋白表達水平比較Fig.2 Comparison of the protein expression levels of MDR1, Pim3 in each group

圖3 各組細胞中Pim3 mRNA表達水平比較 (n=3)Fig.3 Comparison of the expression levels of Pim3 mRNA in each group (n=3)

3 討 論

目前對腫瘤的治療多采用放療、化療、手術等綜合治療，但隨著對中草藥認識的深入，中草藥在腫瘤治療中也發揮了獨特的作用，與化療藥物聯合應用可增效解毒、延長生命、改善患者生存狀態，已成為近年來研究的熱點。槐耳又名槐栓菌，為寄生于槐樹上的木耳，是一種非常重要的藥用真菌，始載于《唐本草》[23]。槐耳清膏作為槐耳菌質的初提物，通過加入相應的輔料、烘干可制作成槐耳顆粒。槐耳因具有抗腫瘤作用，現已廣泛應用于原發性肝癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤的輔助治療[24-26]。單中心研究發現，槐耳顆粒治療成人慢性粒細胞白血病慢性期患者的總有效率可達80%[27]。本研究發現，槐耳可劑量依賴性地抑制CEM-C1、CEM-C7細胞的增殖并促進其凋亡，表明槐耳對ALL細胞具有抗腫瘤效應。有研究表明，槐耳可逆轉肝癌、胃癌等腫瘤細胞的耐藥性[28-30]。Qu等[31]的研究發現，槐耳可增強伊馬替尼在Ikaros基因亞型6(ikaros isoform 6，Ik6)陽性及Ph染色體陽性的急性淋巴細胞白血病(Ik6+Ph+ALL)中的敏感性。本研究發現，與單用DEX比較，100 μg/ml槐耳聯合DEX可進一步抑制CEM-C1細胞的增殖，耐藥逆轉倍數為1.34倍。與對照組(0 μg/ml槐耳)比較，200、600 μg/ml 槐耳組的G0/G1期細胞比例降低，S期細胞比例增高，提示槐耳可在一定程度上阻滯細胞的G0/G1期，減少細胞分裂增殖，從而促進細胞凋亡，部分逆轉CEM-C1細胞對GC的耐藥性。本研究還發現，與GC敏感株CEM-C7細胞比較，GC耐藥株CEM-C1細胞中多藥耐藥基因MDR1呈高表達，經槐耳處理后，CEM-C1細胞中MDR1的表達呈劑量依賴性的下降，與童琳等[12]在肝癌中的研究結果相似。以上結果表明，槐耳可在一定程度上逆轉ALL細胞的耐藥性，并增強CEM-C1細胞對DEX的敏感性。

Pim3基因最初是通過病毒插入篩選發現的，該基因可促進淋巴瘤的發展[32-33]。作為Pim家族中的一員，Pim3位于22號染色體(22q13)，是發現最晚、研究最少的一個亞型[34-35]。Pim3參與介導多種腫瘤的發生發展，在胃癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、急性白血病及淋巴瘤等惡性腫瘤中均呈高表達[36-41]。還有研究發現抑制Pim3能抑制前列腺癌、肝癌、胃癌等腫瘤的進展[36-37,42]。作為新近發現且研究較少的一個亞型，Pim3還被發現與多種腫瘤耐藥相關：Guo等[37]發現，沉默Pim3能逆轉胃癌耐藥；Xu等[20]發現，沉默Pim3可抑制胰腺癌細胞的增殖并增加其對吉西他濱化療的敏感性。本研究結果顯示，耐藥細胞CEM-C1中Pim3蛋白及mRNA表達水平均高于敏感細胞CEM-C7，提示Pim3可能參與介導了ALL的耐藥；采用不同濃度槐耳處理CEM-C1細胞后，其Pim3蛋白及mRNA表達水平均明顯降低，表明Pim3可能是槐耳逆轉ALL耐藥性的靶點之一。因此，以Pim3為目的基因的基因抑制可能為逆轉ALL耐藥提供新的治療策略及治療靶點。

綜上所述，槐耳作為一種中成藥制劑，可抑制ALL細胞的增殖并促進其凋亡，調節細胞周期，增強白血病細胞對GC的敏感性，其作用機制可能與下調Pim3有關。本研究結果為槐耳輔助治療ALL提供了新的理論依據，槐耳抑制Pim3基因的表達可能是一種潛在的治療ALL耐藥的有效方法，但其具體機制尚需進一步深入研究。