干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克豬繼發(fā)肝損傷的變化特點及機制

吳彬，游云，沈才福,3，夏亮，楊欣悅，李輝文，劉江偉*，戴勇華

1新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點實驗室，烏魯木齊 830000；2解放軍聯(lián)勤保障部隊臨潼康復(fù)療養(yǎng)中心，西安 710000；3陸軍957醫(yī)院消化血液內(nèi)分泌科，西藏阿里地區(qū) 859000；4解放軍69223部隊衛(wèi)生連，新疆阿克蘇 842300

失血性休克是由多種原因造成的機體有效循環(huán)血量銳減，重要組織器官灌注不足、缺血缺氧，以及各種炎性因子大量釋放，繼發(fā)各重要臟器部分或全部可逆或不可逆損傷的一系列病理變化過程[1-2]， 其中以創(chuàng)傷失血性休克較為多見，造成創(chuàng)傷休克的主要原因有暴力打擊、高空墜落、交通事故等[3]。 創(chuàng)傷發(fā)生時腹部臟器因缺少骨骼的有效保護，受到暴力打擊后損傷更為直接、嚴(yán)重，如肝、腎損傷等[4]。 在大量失血及直接暴力的雙重作用下，急性肝、腎損傷常可危及生命。我國西北地區(qū)夏季日照時間長、氣溫高，加之距離海洋遠、氣候干旱、空氣濕度低，在極端干熱條件下機體丟失水分量劇增，血液濃縮，血容量相對較少，在遭受創(chuàng)傷后機體代償能力明顯下降[5]，更易誘發(fā)休克，創(chuàng)傷性休克使得肝臟等血供豐富的器官發(fā)生損傷且程度更為嚴(yán)重[6]。 目前國內(nèi)外沙漠干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克繼發(fā)肝損傷相關(guān)的研究較少。本研究建立血壓控制型創(chuàng)傷失血性休克豬模型，探討沙漠干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克繼發(fā)肝損傷的變化特點及其可能機制，以期為進一步研究及臨床救治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 勻漿內(nèi)腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β) ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；高遷移率族蛋白B-1(high mobility group box-1，HMGB-1)兔多克隆抗體(ab228624)、二抗山羊抗兔(ab205718)、β-actin抗體小鼠單克隆抗體(a b 8 2 2 6，英國A b c a m 公司)；肝組織內(nèi)細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)抗體(ab2796798，美國SouthernBiotech公司)。全自動生化分析儀(美國Abbott Aeroset公司)；環(huán)境模擬于西北特殊環(huán)境人工實驗艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院自主研發(fā))。

1.2 實驗分組及血壓控制型失血性休克模型建立 健康雄性長白仔豬60只，體重27～32 kg，由新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司提供，實驗前一周運抵動物實驗室飼養(yǎng)，確保健康并使其適應(yīng)環(huán)境。隨機分為干熱創(chuàng)傷失血性休克組(dry heat trauma hemorrhagic shock group，DHS組，n=20)、干熱創(chuàng)傷失血性休克假手術(shù)組(dry heat trauma hemorrhagic shock sham operation group，DHC組，n=20)與常溫創(chuàng)傷失血性休克組(normal temperature trauma hemorrhagic shock group，NTS組，n=20)。各組分別在相應(yīng)環(huán)境[干熱環(huán)境：溫度(40.5±0.5) ℃，濕度(10±2)%；常溫環(huán)境：溫度(25.0±0.5) ℃，濕度35%±5%]下暴露3 h后建模，實驗前12 h禁食、4 h禁水。肌注氯胺酮(20 mg/kg)及阿托品(0.05 mg/kg)誘導(dǎo)麻醉，1.5%～3.0%七氟烷維持麻醉，利用心電監(jiān)護儀監(jiān)測生命體征，BL-420生物機能實驗系統(tǒng)監(jiān)測體溫。麻醉成功后，暴露雙側(cè)股動脈，右側(cè)股動脈用于監(jiān)測動脈血壓，左側(cè)股動脈用于快速放血。腹正中入路開腹，膀胱造瘺。DHS組、NTS組切除脾臟及部分肝臟，稱重，并輸注3倍于脾重量的乳酸林格液[7-8]，DHC組不切除脾臟及部分肝臟，不予以股動脈放血，其他操作同上述兩組。模擬休克模型[9]后，快速放血并監(jiān)測平均動脈壓(MAP)在(45±5) mmHg，穩(wěn)定20 min后記錄為休克初始時間(0 min)。各組分別于建模成功后0 min(T0)、50 min(T1)、100 min(T2)、150 min(T3)用3%戊巴比妥鈉注射液(美國Sigma公司)安樂處死。取剩余肝組織，分別于多聚甲醛中固定或液氮中保存待測。實驗過程符合國家及單位關(guān)于動物管理和使用的 規(guī)定。

1.3 HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化 建模成功后T0、T1、T2、T3時，快速切取肝組織，用10%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.4 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine amino transferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate amino transferase，AST)含量測定 建模成功后T0、T1、T2、T3時，經(jīng)左側(cè)股動脈抽取3 ml血液，4 ℃下靜置2 h，常溫下3000 r/min離心10 min，采用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST含量。

1.5 ELISA法檢測肝組織TNF-α、IL-1β水平 取凍存的肝組織，稱重并與勻漿緩沖液混合(每100 mg組織加入1 ml緩沖液)，4 ℃孵化1 h，12 000 ×g離心，取上清，采用TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒檢測450 nm處各孔光密度(A)值，計算TNF-α、IL-1β 水平。

1.6 Western blotting檢測肝組織中HMGB-1、ICAM-1的表達 取出液氮凍存的肝組織0.2 mg，液氮研磨、裂解、離心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)，BCA法測定總蛋白濃度，取上清液與上樣緩沖液混合煮沸，離心取上清，行10% SDS-PAGE凝膠蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、5% BSA封閉，加入一抗ICAM-1 (1:1000)、HMGB-1(1:1000)、β-actin(1:2000)，4 ℃下孵育過夜，洗膜，加入二抗(1:3000)常溫孵育2 h，洗膜，用ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)成像后分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，組間及組內(nèi)各時間點比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肝組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，DHS組在不同時間點均出現(xiàn)了肝組織病理變化，建模成功T0時少量肝竇輕度擴張、充血，肝小葉、匯管區(qū)尚清晰，肝細胞結(jié)構(gòu)正常。T1時肝竇輕度擴張、內(nèi)有充血，少量炎性細胞浸潤；肝小葉、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)欠清晰，個別肝細胞顆粒樣變性。T2時肝竇中度擴張、充血，炎性細胞浸潤并伴有少量嗜酸性粒細胞；部分肝小葉、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝細胞變性、壞死。T3時肝竇擴張并彌漫性充血，炎性細胞浸潤，肝細胞呈片狀壞死，肝細胞核濃縮，小葉結(jié)構(gòu)破壞，可見肝靜脈血栓形成。NTS組在T0、T1時肝竇未見明顯擴張，肝小葉、匯管區(qū)清晰，肝細胞結(jié)構(gòu)基本正常，隨休克時間延長肝組織病理變化逐漸加重，至T3時可見肝竇擴張、少量充血，肝小葉、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)稍紊亂，炎性細胞浸潤，肝細胞輕度變性。DHC組自T2開始有少量肝竇輕度擴張，未見其他明顯病理變化(圖1)。

圖1 創(chuàng)傷失血性休克豬不同時間點肝組織病理學(xué)變化(HE ×400)Fig.1 Pathological changes of liver tissue at different time points of pigs with traumatic hemorrhagic shock (HE ×400)

2.2 各組血清ALT、AST含量變化 DHS組與NTS組ALT及AST均呈動態(tài)變化且變化趨勢基本一致。與DHC組比較，DHS組血清ALT及AST在T0時即開始升高(P＜0.01)，T1時達到第一個峰值，后平穩(wěn)下降，T3時再次升高，且較T1時峰值更高(P＜0.01)；與NTS組比較，除T0時，DHS組各時間點血清ALT及AST含量均較高(P＜0.01)。DHC組各時間點血清ALT及AST含量均未出現(xiàn)明顯變化(P＞0.05，圖2)。

2.3 各組肝組織TNF-α、IL-1β水平變化 與NTS組、DHC組比較，DHS組TNF-α、IL-1β水平T0時均開始升高(P＜0.01)，且隨時間推移DHS組與NTS組呈持續(xù)增高趨勢，各組內(nèi)后一時間點與前一時間點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，組間相同時間點比較，DHS組較NTS組升高更為迅速，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。DHC組各時間點TNF-α、IL-1β水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖3)。

圖2 各組創(chuàng)傷失血性休克豬不同時間點血清ALT、AST含量變化Fig.2 Changes of serum ALT and AST at different time points of pigs with traumatic hemorrhagic shock

圖3 各組創(chuàng)傷失血性休克豬不同時間點肝組織TNF-α、IL-1β水平變化Fig.3 Changes of TNF-α and IL-1β levels at different time points of pigs with traumatic hemorrhagic shock

2.4 干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克豬肝組織HMGB-1、ICAM-1表達水平變化 T0、T1、T2、T3時，DHS組肝組織HMGB-1的相對表達量分別為0.26±0.03、0.55±0.02、1.15±0.10、2.89±0.34，后一時間點與前一時間點比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；ICAM-1的相對表達量分別為0.33±0.04、0.63±0.03、1.08±0.12、1.89±0.28，后一時間點與前一時間點比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖4)。

3 討 論

圖4 干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克豬肝組織HMGB-1、ICAM-1表達水平變化Fig.4 Changes of the expression levels of HMGB-1 and ICAM-1 protein in liver tissue of pigs with traumatic hemorrhagic shock at different time points exposed under dry heat environment

創(chuàng)傷失血性休克發(fā)生后全身有效循環(huán)血量銳減，相繼或同時出現(xiàn)外周組織灌注不足、微循環(huán)障礙、炎性因子大量釋放等一系列病理生理改變，此時機體迅速啟動神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)機制，使血液重新分配至重要臟器，機體需氧量增加以保證休克代償期的供能。然而，在沙漠干熱環(huán)境下機體蒸發(fā)失水量巨大，體液嚴(yán)重不足，各個屏障功能減弱，防御機制受阻，機體代償能力下降，尤其對缺血缺氧較為敏感的臟器代償能力急劇下降。肝臟作為腹腔內(nèi)最大的實質(zhì)臟器，有著較為豐富的血液供應(yīng)，一般環(huán)境下失血性休克發(fā)生早期，重新分配的血液可基本供應(yīng)肝臟進行應(yīng)激性代償調(diào)節(jié)，保證重要臟器的血供。但本研究發(fā)現(xiàn)，沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克豬自模型建立初始即出現(xiàn)肝損傷病理變化，且隨著時間的推移，肝損傷進展迅速，很快達到不可逆的變性、壞死階段，這一系列的變化過程可能與干熱環(huán)境下體液丟失較多、血液濃縮缺氧，并伴隨著機體的應(yīng)激反應(yīng)、代償能力急劇下降有關(guān)，雖然急性缺血缺氧導(dǎo)致血液重新分布進入肝臟，但進入肝臟的血液含氧量低且相對減少，肝組織損傷嚴(yán)重且變化迅速，肝臟容量血管失去正常的調(diào)節(jié)作用，血液淤滯于肝臟內(nèi)，加之肝組織內(nèi)單核/巨噬細胞防御功能減弱，腸道細菌轉(zhuǎn)移、內(nèi)毒素大量釋放進入肝門靜脈，加重肝損害，促進了炎性介質(zhì)釋放。這一系列應(yīng)激、級聯(lián)反應(yīng)對肝臟造成了嚴(yán)重打擊，這也可能是肝細胞凋亡的重要誘因[10]。當(dāng)大量肝細胞凋亡無法被吞噬細胞清除時，會刺激炎性細胞向肝臟遷移，并持續(xù)釋放炎性因子，形成惡性循環(huán)[11-12]。 同時肝臟血管內(nèi)皮細胞損傷，凝血功能障礙誘發(fā)血栓形成，使肝內(nèi)血液循環(huán)受阻并導(dǎo)致肝臟衰竭，最終引發(fā)多器官功能障礙綜合征(MODS)[13-14]。

肝臟作為人體最大的消化腺及代謝器官，內(nèi)含各種豐富的酶，當(dāng)肝臟受損時儲存在肝細胞內(nèi)的酶釋放入血，血清中相關(guān)酶含量升高可間接反映肝臟損傷的程度。ALT與AST作為臨床上診斷急性肝損傷的指標(biāo)被廣泛運用，前者主要分布于肝細胞質(zhì)中，后者主要儲存于肝細胞線粒體中，兩者對肝細胞損傷的靈敏度均較高[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，每1%的肝細胞壞死即可導(dǎo)致血液中ALT活性增高1倍[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，干熱環(huán)境及常溫環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克豬血清ALT及AST均呈動態(tài)變化，且變化趨勢基本一致；與DHC組比較，DHS組T0時即出現(xiàn)ALT和AST升高，T1及T3時分別達到高峰，且T3較T1時峰值更高；除T0時，DHS組各時間點血清ALT及AST含量均較NTS組高；DHC組各時間點均未出現(xiàn)明顯變化。ALT及AST作為肝損傷的敏感性指標(biāo)，在肝細胞被破壞時即釋放入血，并在短時間內(nèi)達到峰值，由此推測，干熱環(huán)境和創(chuàng)傷失血性休克的雙重打擊使機體肝細胞受到損傷，且隨著時間延長，損傷程度進一步加重，此時機體啟動了調(diào)節(jié)機制，調(diào)動周圍血管內(nèi)的血液進入肝、腎、腦等重要器官，以保證血液及氧的供應(yīng)，并為延緩重要器官的不可逆損傷提供時間；其次肝臟內(nèi)血供極為豐富，具有肝動脈及門靜脈兩套供血系統(tǒng)，一套血供不足或攜氧量下降時可由另一套作為補充，沙漠干熱環(huán)境下雖然血容量減少、機體代償功能下降，但相應(yīng)的代償能力并沒有消失，其獨特的血供系統(tǒng)可能是保證肝臟短時間正常運轉(zhuǎn)的重要條件，但平衡再次被打破，肝臟很快進入失代償階段，ALT及AST再次升高，表明肝臟缺血缺氧及損傷程度不斷加重；而常溫環(huán)境下，機體代償能力相對完好，ALT及AST再次升高較為延緩，肝損傷進程相對緩慢。

TNF-α、IL-1β作為最具代表性的炎性因子在全身或局部炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色。在肝臟內(nèi)TNF-α與IL-1β主要由Kupffer細胞釋放[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，沙漠干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克豬模型建立后，出現(xiàn)了特殊的肝臟代償及缺血再灌注損傷，與常溫環(huán)境下比較，各時間點TNF-α與IL-1β在肝內(nèi)表達量增加。分析其原因可能為，沙漠干熱環(huán)境下肝損傷激活了更多的Kupffer細胞，可上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)p38亞族信號分子[18]的表達，合成并釋放大量的TNF-α、IL-1β，從而誘導(dǎo)中性粒細胞釋放更多的氧自由基(ROS)，形成大量脂質(zhì)化過氧化物(LPO)。LPO可裂解生成具有細胞毒性的丙二醛(MDA)，后者是造成細胞核酸突變及蛋白質(zhì)變性的重要物質(zhì)，最終導(dǎo)致組織器官損傷[19-20]。此外，作為一種趨化因子，IL-1β可促進T淋巴細胞活化及B淋巴細胞分泌抗體，誘導(dǎo)肝細胞損傷急性期合成各種蛋白，上調(diào)中性粒細胞的功能，增強炎癥反應(yīng)對肝細胞的破壞作用；而TNF-α具有肝細胞毒性，可直接引起肝細胞壞死，并與內(nèi)毒素及其他炎性介質(zhì)相互作用，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，加重急性肝損傷。肝內(nèi)上述兩種炎性因子水平升高可直接或間接對肝臟產(chǎn)生破壞作用，尤其在沙漠干熱環(huán)境下TNF-α與IL-1β均較常溫環(huán)境下表達增加，表明肝細胞內(nèi)炎性因子表達增強并對肝細胞產(chǎn)生破壞，從而引發(fā)更為嚴(yán)重的肝損傷。而DHC組TNF-α及IL-1β水平并未出現(xiàn)明顯的升高，可能是因未造成創(chuàng)傷失血性休克，短時間內(nèi)機體調(diào)動代償機制，對肝細胞沒有造成實質(zhì)性的破壞。

作為一種炎性介質(zhì)，HMGB-1在創(chuàng)傷失血性休克、膿毒癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤等多種疾病中發(fā)揮重要作用[21-22]。HMGB-1主要在巨噬細胞內(nèi)合成并釋放到細胞外，而TNF-α、IL-1β、IL-18等炎性介質(zhì)可促進HMGB-1的合成及釋放[23]。被釋放的HMGB-1與晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)結(jié)合，激活MAPK、p38、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使MAPK發(fā)生磷酸化，引起核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)激活并最終啟動炎癥應(yīng)答，且可指導(dǎo)趨化因子、細胞因子的遷移活動[24]。此外激活上調(diào)的p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可促進TNF-α及IL-1β的釋放，加重炎癥反應(yīng)。ICAM-1是一種黏附分子，主要存在于肝血管內(nèi)皮細胞表面，其結(jié)構(gòu)為跨膜單鏈糖蛋白[25]，正常情況下表達非常少，組織損傷后，經(jīng)上游信號通路(NF-κB)調(diào)控后表達量增加，當(dāng)ICAM-1異常表達時可引起內(nèi)皮損傷。在炎癥反應(yīng)中，ICAM-1可將單核/巨噬細胞、淋巴細胞等向血管內(nèi)皮黏附，牽引白細胞向炎癥區(qū)移行，并促使白細胞釋放更多炎性介質(zhì)和細胞因子。另外，ICAM-1在肝內(nèi)可募集各種炎性細胞阻塞肝臟微循環(huán)，導(dǎo)致肝臟缺血缺氧，進一步加重肝損傷[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，在TNF-α、IL-1β的作用下，ICAM-1表達明顯增加，TNF-α、IL-1β與ICAM-1具有相互促進的作 用[27-28]。由此可見，ICAM1、TNF-α、IL-1β在炎癥反應(yīng)中均起著重要作用。

綜上所述，干熱環(huán)境創(chuàng)傷失血性休克豬繼發(fā)肝損傷可能與激活了更多的Kupffer細胞，上調(diào)p38信號分子，促使TNF-α、IL-1β大量釋放，并進一步引起HMGB-1、ICAM-1高表達有關(guān)，上述炎性因子相互協(xié)同并促進肝組織損傷。如何提高機體在特殊環(huán)境下的耐受力，減輕應(yīng)激損傷，抑制或減緩炎性因子的釋放，是特殊環(huán)境下失血性休克繼發(fā)肝損傷防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前干熱環(huán)境下創(chuàng)傷失血性休克的相關(guān)研究尚處于初始階段，其具體機制仍有待深入探討。