無溶媒結晶技術在維生素B12生產中的應用

程俊山，李賀，楊繼宗，潘麗紅，顧曉菲，張苗靜

(華北制藥河北萊欣藥業有限責任公司，河北 石家莊 052165)

維生素B12(vitamin B12)，是一類含鈷的復雜有機化合物，是目前已發現的最大、最復雜的維生素分子，其結構性質非常穩定，可溶于水、乙醇和丙酮，因其結晶為紅色，故又稱紅色維生素[1-2]。維生素B12是維持人類生命不可缺少的重要物質，其作用主要是維持正常造血機制；參與人體細胞的代謝，影響DNA的合成與調節，參與脂肪酸的合成和能量的生成[3-6]。維生素B12已被廣泛應用于醫藥、食品和畜牧業，目前中國已成為全球維生素B12的主要產地，因此對其合成過程進行研究具有重要的現實意義。

現階段工業制造方法均采用微生物發酵法，其生物合成過程比較復雜[7-8]。文獻報道的維生素B12為好氧合成路徑[9-10]，后提取過程為維生素B12發酵結束后通過加熱，將集中在胞內的維生素B12釋放到胞外，過濾收集濾液，然后經吸附、解吸、轉化、再吸附、再解吸、結晶、重結晶、干燥等步驟得到維生素B12的成品。結晶過程是制藥行業重要的環節,結晶技術直接影響成品的質量，所以本文重點研究維生素B12的結晶制備技術。

目前行業內通用的結晶生產工藝是溶媒結晶法，其工作原理是通過向維生素B12料液中加入特定的溶媒相，以降低維生素B12在混合相中的溶解度，使維生素B12結晶體析出的過程。溶媒結晶法技術成熟, 操作較為簡單,但主要缺點是生產過程中產生大量含溶媒廢液，企業無法自行處理廢液，“三廢”排放存在超標風險。溶媒使用過程也會造成大氣污染問題，其易燃易爆的特性，也給企業生產增加了安全隱患。因此急需開發新的維生素B12結晶工藝，以達到生產、安全、環保、成本等多方面優化的目的。

本文創新性地提出一種無溶媒結晶制備方法，利用響應面分析法優化結晶工藝參數，以維生素B12凈化液為原料，通過控制溫度、真空度，持續蒸發去除溶劑，再利用溫度差使結晶液溶解度下降，得到維生素B12產品，重點是控制減壓蒸發使維生素B12在不被破壞的情況下析出晶體。通過去除結晶過程中的溶媒，降低生產與環保成本，提高生產過程的安全性，同時工時、除雜效果滿足生產要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；真空旋轉蒸發儀(鞏義市予華儀器有限公司)。維生素B12凈化液取自華北制藥河北萊欣藥業有限責任公司，其他試劑均為工業級，水為反滲透(reverses osmosis，RO)水。

1.2 無溶媒結晶工藝方法

向結晶罐中加入維生素B12凈化液，開啟攪拌。將凈化液減壓升溫蒸餾,在蒸餾過程中，分別記錄并檢測加熱至60、65、70、75 ℃，對應真空度分別為0.06、0.07、0.08、0.09 kPa狀態時凈化液的效價及雜質含量的變化。將濃縮的凈化液分別留樣，常壓冷卻溫度至10 ℃±1 ℃后，分別將結晶液過濾、干燥，得到的維生素B12晶體成品。

對無溶媒結晶過程中蒸發溫度、真空度、結晶前溶液效價等工藝條件進行優化，并進行數據結果比對，以提高主產物質量分數及相關雜質質量分數水平。

1.3 質量分數的檢測方法

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

以w(VB12)、最大單雜為考察指標，選取蒸發溫度為60、65、70、75 ℃，真空度為0.06、0.07、0.08、0.09 kPa，溶液效價為80 000、85 000、90 000、95 000 μg/mL，進行單因素試驗，初步優化制備工藝。

2.1.1 蒸發溫度的選擇

按照1.2項下方法進行試驗，量取維生素B12凈化液，真空度控制在0.08 kPa，溶液效價為80 000 μg/mL時，考察了蒸發溫度對w(VB12)的變化。由圖1可以看出，w(VB12)在蒸發溫度增加后先升高再降低，超過65 ℃后w(VB12)下降明顯。

圖1 蒸發溫度對w(VB12)及有關物質指標的影響Fig.1 The effect of evaporation temperature on w(VB12) and related substances

2.1.2 真空度的選擇

按照1.2項下方法進行試驗，量取維生素B12凈化液，蒸發溫度為65 ℃、溶液效價為80 000 μg/mL時，考察了真空度對w(VB12)的變化(圖2)。由圖2得到真空度的增加對有關物質指標的影響不大，但隨著真空度的上升，w(VB12)顯著提高。

圖2 真空度對w(VB12)及有關物質指標的影響Fig.2 The effect of vacuum degree on w(VB12) and related substances

2.1.3 溶液效價的選擇

按照1.2項下方法進行試驗，量取維生素B12凈化液，蒸發溫度至65 ℃、真空度為0.09 kPa時，考察了溶液效價對w(VB12)的變化(圖3)。由圖3可知在溶液效價考察項中，隨著效價的增加，w(VB12)先逐漸上升，再緩慢下降。綜合上述情況分析，選定蒸發溫度62.5～67.5 ℃、真空度為0.08～0.09 kPa、溶液效價為87 500～92 500 μg/mL。在此條件范圍內，維生素B12的有關物質指標能達到內控要求，但質量分數變化波動較大，故應用響應面分析法對維生素B12質量分數進一步展開研究。

圖3 溶液效價對w(VB12)及有關物質指標的影響Fig.3 The effect of concentration on w(VB12) and related substances

2.2 響應面法優化無溶媒結晶工藝參數

2.2.1 試驗設計

根據單因素試驗結果，采用Box-Behnken數據模型，選擇蒸發溫度(A)、真空度(B)和溶液效價(C)為響應面的3個因素，以w(VB12) (Y)為響應值設計試驗，其因素水平見表1。

表1 響應面試驗的因素及水平

2.2.2 響應面法試驗結果

按照表1中因素及水平，無溶媒結晶工藝的響應曲面試驗設計方案及試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計和結果

2.2.3 模型的建立與分析

運用Design-Expert軟件對試驗結果進行回歸擬合，得到w(VB12)(Y)對蒸發溫度(A)、真空度(B)、溶液效價(C) 3個因素的二次多項回歸擬合方程：

Y=98.38-0.22A+0.21B-0.037C-0.10AB+0.050AC+0.025BC-1.30A2-0.28B2-0.28C2。

表3 響應面回歸模型的方差分析

2.2.4 各因素間的交互作用

通過Design-Expert軟件分析，繪制回歸模型的響應面和等高線，由圖4～6可以看出，等高線均為橢圓形，故A、B、C等3個因素兩兩交互作用顯著，對w(VB12)的影響程度由大到小為：AB、AC、BC，結果與回歸模型方差分析一致。

圖4 蒸發溫度和真空度的響應曲面及等高線Fig. 4 Response surface and contour map for evaporation temperature and vacuum degree

圖5 蒸發溫度和溶液效價的響應曲面及等高線Fig. 5 Response surface and contour map for evaporation temperature and concentration

圖6 真空度和溶液效價的響應曲面及等高線Fig.6 Response surface and contour map for vacuum degree and concentration

2.2.5 最佳工藝條件及驗證試驗

根據二次多項式回歸方程得到最佳工藝參數：蒸發溫度64.743 ℃、真空度0.087 kPa、溶液效價89 851 μg/mL，在此結晶工藝條件下(具體數據見表4)，w(VB12)的理論值為98.44%。

結合生產實際可操作性，并進一步驗證模型方程的適用性與可靠性，最終采用蒸發溫度65.0 ℃、真空度0.090 kPa、溶液效價90 000 μg/mL，進行制備維生素B12的無溶媒結晶試驗，平行試驗3次，結果平均w(VB12)達到98.50%，與理論值誤差0.06%，表明響應面分析法所得w(VB12)驗證值與回歸方程預測值較為吻合，調整后得到的條件依然可靠可行。

表4 驗證w(VB12)結果

2.2.6 質量指標

驗證應用無溶媒結晶工藝制備的樣品(A1～A3)與溶媒結晶工藝制備的樣品(B1～B3)進行質量指標對比，具體結果見表5。由數據可以看出，應用無溶媒結晶工藝制備的產品，質量符合生產要求，相較之前溶媒結晶工藝，制備產品的雜質水平略有優勢。通過表5各檢測項目的相對標準偏差(RSD)值對比，說明新工藝穩定可靠。

表5 不同工藝樣品質量檢測結果

選取樣品A1和B1進一步做穩定性考察試驗，設置條件：40 ℃±2 ℃、RH 75%±5%，放置3個月，質量指標結果見表6。由數據可以看出，應用無溶媒結晶工藝制備的產品，相較之前溶媒結晶工藝制備產品的穩定性略好。

表6 不同工藝樣品加速試驗結果

2.2.7 工業化研究

經穩定性考察試驗及風險評估分析后，應用無溶媒結晶工藝進行3批試生產(批重量80～100 kg)，經統計各質量指標均符合行業標準要求(表7)，因此，本文對產業化生產具有指導意義。

表7 試生產產品質量結果

3 結論

本研究利用維生素B12的溶解性的特點，將溶媒析晶改為降溫析晶，通過單因素試驗，考察蒸發溫度、真空度、溶液效價等參數對產品質量的影響，并進一步應用響應面分析法優化無溶媒結晶工藝，優化后工藝條件穩定，制出的成品維生素B12含量高、質量指標較好。無溶媒結晶工藝質量穩定性優于溶媒結晶工藝，經試生產放大后，各質量指標滿足企業內控要求，在提高生產安全性的同時，大幅減少了對環境的污染，同時減少了相關工序，有效地降低了生產成本，操作簡單，效果明顯。該方法為國內首創，技術處行業領先水平，具有極高的工業推廣價值。