生物力學(xué)作用對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化影響研究進(jìn)展

曹盛楠，師彬，孫國棟，王從安，王丹丹*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 針炙推拿學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)a.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬頸肩腰腿痛醫(yī)院；b.山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心 山東省骨生物力學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250012；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250062；4. 天津大學(xué) 醫(yī)學(xué)工程與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，天津 300072)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(boneless marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一類具有自我增殖、多向分化潛能的干細(xì)胞，具備免疫源性低、方便取材、來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，常用于細(xì)胞組織移植、心血管疾病、骨缺損修復(fù)等多個領(lǐng)域[1-2]。研究認(rèn)為BMSCs在生長過程中可感知不同的生物力學(xué)信號，從而影響細(xì)胞增殖、成骨分化等功能，而體內(nèi)BMSCs的生長、成骨分化與骨組織的再生等也離不開復(fù)雜的力學(xué)作用環(huán)境[3-4]。目前已有相關(guān)力學(xué)對BMSCs影響的研究[5-6]，但采用的力學(xué)加載模式、時間、頻率等皆不盡相同，且不同的作用力對BMSCs增殖、分化的影響不同。本文闡述了不同生物力學(xué)(牽張力、壓力、流體剪切力)對BMSCs增殖與成骨分化的影響，及其可能作用的基因和信號傳導(dǎo)通路等，為BMSCs的骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究及更好地應(yīng)用于臨床治療提供參考。

1 不同牽張力作用對BMSC增殖和成骨分化的影響

牽張力(mechanical tension stress，MTS)作為一個重要機(jī)械調(diào)節(jié)因素，對BMSCs起到拉伸應(yīng)力作用[7]。目前國內(nèi)外已有多種不同力學(xué)加載設(shè)備及力學(xué)刺激方式，其中研究較多的為牽張力。研究證實(shí)牽張力可有效促進(jìn)細(xì)胞活性和功能，在骨再生和骨生物工程的臨床應(yīng)用中有重要指導(dǎo)意義[8]。但不同牽張力對BMSCs的增殖及成骨分化有不同的影響。

細(xì)胞的受力大小是無法測量出來的，只能間接通過硅膠膜的形變率、支撐物的上下運(yùn)動位移來估計(jì)(根據(jù)牽拉頭尺寸參數(shù)表計(jì)算, 文中力的強(qiáng)度用百分?jǐn)?shù)來表示)。黎潤光等[9]參考Schaffer建模方法自行建立體外細(xì)胞周期性機(jī)械牽張力學(xué)裝置，在1.0 Hz的頻率下，分別采用不同應(yīng)力大小、不同時間的機(jī)械信號刺激，結(jié)果表明12%應(yīng)力作用下增殖指數(shù)最高，可達(dá)到無應(yīng)力狀態(tài)下的1.86倍，而采用過強(qiáng)的牽張應(yīng)力(18%)時，對細(xì)胞不具有促進(jìn)增殖效應(yīng)；同時，牽張力干預(yù)早期可以促進(jìn)BMSCs增殖，干預(yù)時間超過48 h反而表現(xiàn)為抑制生長狀態(tài)。井燕等[10]采用雙軸力學(xué)應(yīng)變系統(tǒng)選取0.4%、1.0 Hz頻率、每天3次、每次2 h、間隔2 h的力學(xué)應(yīng)變加載BMSCs，力學(xué)應(yīng)變作用后細(xì)胞增殖指數(shù)(proliferation index, PI)比相應(yīng)靜態(tài)組增高，動物骨橋蛋白 ( Osteopontin, OPN) 和堿性磷酸酶 ( Alkaline phosphatase, ALP)的表達(dá)均有明顯升高，表明力學(xué)應(yīng)變可以提高BMSCs的增殖和成骨分化能力。戚孟春等[11]采用四點(diǎn)彎曲加力系統(tǒng)施加的40 min、0.2%機(jī)械牽張力作用于大鼠BMSCs，發(fā)現(xiàn)受力組在受力后細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組，BMSCs增殖活力顯著增高并短暫性成骨向分化。通過加載機(jī)械張力，模擬骨組織受力情況發(fā)現(xiàn)，不同大小、時間、頻率的機(jī)械張力均影響B(tài)MSCs增殖，大小適宜的機(jī)械張力可起到促進(jìn)作用。

高鶯等[12]同樣采用四點(diǎn)彎曲加力系統(tǒng)對SD大鼠BMSCs施加0.2%機(jī)械牽張力，結(jié)果顯示其細(xì)胞生長曲線與對照組相比差別不大，但骨鈣素表達(dá)水平和ALP活性顯著增高，且芯片雜交檢測的差異表達(dá)基因數(shù)量變化明顯。薛令法等[13]采用Flexcell體外細(xì)胞力學(xué)加載裝置，施加0.5 Hz頻率、0.8% 形變率、每天2次、每次30 min的間歇性牽張力，可促進(jìn)小鼠BMSCs成骨分化。Wu等[14]通過Flexercell-5000給予人BMSCs機(jī)械拉伸(10%，0.5 Hz)，數(shù)據(jù)顯示LncRNA H19通過上調(diào)下游FAK來介導(dǎo)牽張力誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化。Jang等[15]采用單軸拉伸應(yīng)力單元系統(tǒng)，分別以3%和10% 拉伸力、0.26 Hz頻率給予兔源BMSCs循環(huán)張力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)張力促進(jìn)BMSCs增殖增加，并且10%牽張力趨向平滑肌細(xì)胞分化，3%牽張力趨向成骨細(xì)胞分化。Song等[16]采用自行組裝的機(jī)械拉伸裝置以1 Hz頻率、2%～8%拉伸15～60 min，經(jīng)MTT檢測后顯示牽張力具有促進(jìn)BMSCs增殖的重要作用，且采用8%應(yīng)變、60 min拉伸處理的BMSCs細(xì)胞c-fos基因表達(dá)明顯升高。通過以上研究發(fā)現(xiàn)，一定條件的周期性力學(xué)信號刺激可以促進(jìn)BMSCs向成骨方向分化，但當(dāng)拉伸幅度及作用時間不同時，可出現(xiàn)不同的細(xì)胞分化方向。

2 不同壓力作用對BMSCs增殖和成骨分化的影響

力學(xué)刺激對細(xì)胞功能及組織發(fā)育、重建等有重要影響作用，BMSCs受到多種應(yīng)力作用，而壓應(yīng)力同樣作為正常人體關(guān)節(jié)運(yùn)動中的主要受力因素，亦可引起細(xì)胞生物力學(xué)特性的變化[17]，在研究中對BMSCs施以壓應(yīng)力(hydrostatic stress，HDS)能很好地模擬細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境，同時又易于標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果間的相互比較與分析[18]。

劉巖正等[19]采用自行設(shè)計(jì)的可控細(xì)胞液壓加載裝置給予BMSCs細(xì)胞相應(yīng)的靜壓力刺激，結(jié)果表明采用90 kPa 靜壓力每天1 h 連續(xù)作用2 d促BMSCs增殖與成軟骨向分化的作用最顯著，PCNA、SOX-9、Aggrecan mRNA 的表達(dá)均顯著升高。何川等[20]采用自制加壓裝置給予BMSCs加載靜水壓，發(fā)現(xiàn)40 kPa的靜水壓連續(xù)作用4 d可以促進(jìn)Cbfa1、OC mRNA表達(dá)，連續(xù)作用7 d時仍對BMSCs表現(xiàn)為促成骨分化作用，在連續(xù)作用14 d時，作用轉(zhuǎn)變?yōu)榇俪芍只＠钫碌萚21]采用自行改制的細(xì)胞壓力加載裝置進(jìn)行力學(xué)干預(yù)BMSCs，結(jié)果顯示分別在5.32、10.64、21.28 kPa壓力干預(yù)下細(xì)胞增殖指數(shù)均明顯升高，MMP-2活性最低；而在29.26 kPa壓力下增殖指數(shù)則明顯下降且死亡增多，基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)活性增高。潘景光等[22]采用自行設(shè)計(jì)制作的細(xì)胞液壓加載裝置對BMSCs經(jīng)動態(tài)壓力處理后，在0～45 kPa和0～90 kPa動態(tài)正壓作用下，BMSCs增殖活性顯著增強(qiáng)，且與壓力值呈正相關(guān)。但通過透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)0～45 kPa動態(tài)壓力作用下可促進(jìn)細(xì)胞蛋白合成，而在0～90 kPa動態(tài)壓力作用下，細(xì)胞中出現(xiàn)了凋亡小體，證實(shí)在該壓力作用下可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。趙永亮等[23]采用 Flexcell-5000基底壓縮加載系統(tǒng)對BMSCs延遲性周期性壓縮應(yīng)力刺激(正弦波、0.5 Hz、20 kPa、2 h/d 壓縮應(yīng)力)，結(jié)果顯示應(yīng)力可促進(jìn)Col2的表達(dá)，抑制ROCK通路，并可能通過ROCK通路調(diào)控BMSCs成軟骨分化。易飛舟等[24]采用自主研發(fā)的細(xì)胞液壓加載裝置，分別對BMSCs加載持續(xù)靜壓力45、90 kPa及周期性動壓力0～45 kPa、0～90 kPa。數(shù)據(jù)顯示90 kPa 靜壓作用下Sox9及Aggrecan基因的表達(dá)量顯著高于0～90 kPa，而0～45 kPa壓力促Sox9及Col2基因上調(diào)的作用則高于45 kPa壓力，且在持續(xù)90 kPa的壓力作用下BMCSs成軟骨分化效果顯著。當(dāng)對BMSCs加載壓力較小時，壓應(yīng)力可促進(jìn)BMSCs增殖且向成骨方向分化，而當(dāng)壓力增大時BMSCs趨向成軟骨方向分化。

3 不同的剪切力作用對BMSCs增殖和成骨分化的影響

骨骼組織中的細(xì)胞在生理狀態(tài)下，需要一定強(qiáng)度的流體剪切應(yīng)力(fluid shear stress, FSS)的刺激，使其保持正常的生理功能，同時，培養(yǎng)液的流動也可對所培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生流體剪切應(yīng)力[25]，有研究表明，一定范圍的流體剪切應(yīng)力可以刺激BMSCs細(xì)胞的分化及增殖，保持細(xì)胞正常的生理功能[26-27]。

李洪鵬等[28]采用自制平行平板流動腔對BMSCs加載0.3 Pa的流體剪切力刺激30 min，結(jié)果表明流體剪切力可提高BMSCs細(xì)胞早期的細(xì)胞內(nèi)ALP含量，細(xì)胞開始向成骨細(xì)胞分化，但未能促使晚期的骨鈣素表達(dá)升高，說明此強(qiáng)度的流體剪切力不能成功促進(jìn)人BMSCs最終實(shí)現(xiàn)向成骨方向分化。李立等[29]將BMSCs置于平行板流動腔內(nèi)，以0.8 Pa切應(yīng)力條件下誘導(dǎo)24 h，發(fā)現(xiàn)BMSCs可轉(zhuǎn)化成內(nèi)皮細(xì)胞。Kreke等[30]以0.16 Pa的流體剪切力作用于大鼠BMSCs細(xì)胞，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(地塞米松、β-甘油磷酸和抗壞血酸)中培養(yǎng)，在第6、8、10和12 d檢測時，流體剪切力促進(jìn)了骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein，BSP)和骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)的表達(dá)，促進(jìn)了OPN蛋白的積累，抑制了脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)的表達(dá)；在第20 d檢測30 min的加載力下，OPN及BSP mRNA的表達(dá)水平達(dá)到最高，同時，持續(xù)120 min時成脂標(biāo)志物脂蛋白脂肪酶的表達(dá)最少。劉立躍等[31]發(fā)現(xiàn)以0.42 Pa間歇性FSS 培養(yǎng)的BMSCs則向成骨細(xì)胞分化明顯，而0.42 Pa持續(xù)性FSS和0.034 Pa的FSS對BMSCs沒有明顯的誘導(dǎo)分化作用。Stavenschi等[32]將BMSCs在封閉環(huán)境中分別給予不同剪切力，發(fā)現(xiàn)剪切力可以促進(jìn)成骨標(biāo)志物Cox2、Runx2 和OPN的mRNA表達(dá)上調(diào)，確定在BMSCs施加2 Hz、2 Pa、FSS時成骨標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)最明顯。Huang等[33]發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)腇SS單獨(dú)處理可以使心肌細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)顯著增加，誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。由此可見，BMSCs的增殖和分化與流體剪切力的刺激有密不可分的聯(lián)系，較低強(qiáng)度的流體剪切力對BMSCs的影響并不大，較高強(qiáng)度的流體剪切力會抑制細(xì)胞的成骨分化。

不同生物力學(xué)作用大小、頻率、作用時間等對BMSCs增殖和成骨分化的影響，以及相關(guān)的作用基因，如表1所示。牽張力一般在24 h內(nèi)，拉伸幅度為12%以下時，主要通過影響ALP、OPN、COLI、Ets1、Cbfa1、osterix、Runx2等基因，促進(jìn)BMSCs增殖和成骨分化；壓力范圍在0～90 kPa，每日加壓時間在1～6 h時，主要通過影響Cbfa1、OC促進(jìn)BMSCs成骨分化；施加剪切力在0.3～2.0 Pa，加載范圍在0.5～2.0 h時，主要通過ALP、OC、Runx2、OCN、COLIα等基因，促進(jìn)BMSCs成骨分化。

表1 不同生物力學(xué)作用大小、頻率、作用時間等對BMSCs增殖和分化的影響

4 生物力學(xué)作用影響B(tài)MSCs增殖和成骨分化參與調(diào)節(jié)的信號傳導(dǎo)通路

細(xì)胞感受力學(xué)信號,通過信號傳導(dǎo)通路，影響基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成[34]，機(jī)械刺激通過影響整合素表達(dá)，繼而整合素將機(jī)械刺激轉(zhuǎn)換為生物力學(xué)信號，實(shí)現(xiàn)對BMSCs的成骨分化調(diào)控。不同力學(xué)刺激BMSCs后，BMSCs的整合素α2β1、α5β1、αVβ3等表達(dá)量升高，同時以整合素為基礎(chǔ)的FAK參與啟動多條信號通路，通過調(diào)控不同的信號通路，進(jìn)而促進(jìn)與成骨分化相關(guān)基因表達(dá)。由此，多種細(xì)胞成分在信號傳導(dǎo)中起到重要的作用，如細(xì)胞骨架、整合素、離子通道等方面參與機(jī)械力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[35]。

Simmons等[36]對人BMSCs施加0.25 Hz、3%形變率的牽張力，激活了細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)和P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，同時發(fā)現(xiàn)p38信號通路在BMSCs應(yīng)變誘導(dǎo)成骨分化的調(diào)控中起抑制作用。劉小雅等[37]采用Flexcell細(xì)胞力學(xué)加載裝置對小鼠BMSCs施加0.5 Hz、0.8%振幅的機(jī)械牽張力，結(jié)果表明在持續(xù)牽張力作用下可通過p38MAPK通路向成骨細(xì)胞分化。由此可見，小幅度的牽張力能通過p38MAPK信號通路促進(jìn)BMSCs成骨分化。趙闖等[38]通過自行研制的細(xì)胞加載裝置對BMSCs施加機(jī)械張應(yīng)力0.25%、加力60 min，提示牽張力加載激活了Wnt信號3個關(guān)鍵分子Wnt3A、β-catenin與Lef-1，并刺激BMSCs增殖與骨向分化過程。另有研究者用Flexcell應(yīng)變裝置對大鼠BMSCs給予機(jī)械張應(yīng)力10%、0.5 Hz頻率，每日2次循環(huán)拉伸刺激，通過短干擾RNA下調(diào)Cbfa1基因表達(dá)后，成骨標(biāo)記物表達(dá)出現(xiàn)下降，證明了牽張力刺激可能通過ERK1/2激活的Cbfa1信號通路促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化[39]。同時，研究表明整合素-FAK信號通路參與了機(jī)械牽張誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的調(diào)節(jié)，整合素介導(dǎo)的FAK活化后，Ras-Raf-MAPK/ERK、FAK-PI3K-Akt等信號通路可能進(jìn)一步激活，調(diào)控細(xì)胞功能[40]。

杜靜等[41]采用自主研發(fā)的靜態(tài)液壓加載裝置對兔BMSCs加載120 kPa、每天1 h、連續(xù)4 d的力學(xué)刺激，結(jié)果顯示壓力刺激后，BMP2及Smad1/Smad5表達(dá)明顯上調(diào)，同時促進(jìn) BMSCs軟骨方向的分化。陳驥等[42]采用自行設(shè)計(jì)制作的可控細(xì)胞液壓加載裝置給予90 kPa壓強(qiáng)加載1 h，提示壓力可以通過激活RhoA的活性可促進(jìn)DNA合成及細(xì)胞增殖，并在成骨誘導(dǎo)早期，依賴RhoA活性，壓力可促進(jìn)BMSCs成骨分化，而在成骨誘導(dǎo)晚期，RhoA活性抑制，OPN下調(diào)，壓力對成骨分化晚期起抑制作用。另有研究者采用可控細(xì)胞液壓加載裝置對大鼠BMSCs施加90 kPa流體靜壓力，結(jié)果顯示BMSCs中Sox9、Aggrecan及ColII的mRNA表達(dá)量增加，且Rac1在流體靜壓力導(dǎo)致的細(xì)胞成軟骨分化過程中亦具有調(diào)控作用[43]。此外，靜水壓力還可通過Wnt-RhoA-ROCK調(diào)節(jié)BMSCs，進(jìn)而影響早期成骨分化標(biāo)志物基因的表達(dá)[44]。

研究者使用平行板培養(yǎng)箱研究剪切應(yīng)力對人BMSCs成骨分化的調(diào)節(jié)能力，結(jié)果顯示在1.2 Pa的流體剪切應(yīng)力作用下，在一段時間內(nèi)對Cbfa1/Runx2基因的表達(dá)有影響，而BMSCs的成骨活性迅速增強(qiáng)，I型膠原基因的表達(dá)下降，這些效應(yīng)依賴于p38和ERK1/2的激活[45]。同時，Liu等[46]證實(shí)通過信號通路，間歇性流體剪切力可以誘導(dǎo)人BMSCs成骨分化。首先β1整合素感知細(xì)胞外間歇性FSS的刺激后，通過激活FAK活化ERK1/2導(dǎo)致Runx2磷酸化，磷酸化的Runx2啟動成骨基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化；其次，間歇性FSS激活的ERK1/2通過激活NF-κB增加BMPs的表達(dá)，BMPs的增加導(dǎo)致BMP/Smad通路的激活，最終導(dǎo)致Runx2的表達(dá)；再次，間歇性FSS激活的ERK1/2通過介導(dǎo)NF-κB的活化影響β1整合素的表達(dá)。

由此可見，不同生物力學(xué)作用影響B(tài)MSCs成骨分化的相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，如圖1所示。牽張力作用下主要通過整合素表達(dá)，啟動FAK-PI3K-Akt、Ras-Raf-MAPK/ERK等信號通路，壓力作用BMSCs后激活Wnt-RhoA-ROCK等信號傳導(dǎo)通路，流體剪切力作用后激活BMPs/Smad、FAK-ERK-NF-κB等信號通路，調(diào)節(jié)下游Runx2、ALP、OCN、OPN、COL等相關(guān)基因的作用，影響B(tài)MSCs的增殖和成骨分化。

5 研究展望

BMSCs是一類來源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞[47]。由于其易于分離培養(yǎng)、體外增殖能力強(qiáng)、成骨分化特性較好，可作為骨組織工程的理想種子細(xì)胞[48]，近幾年研究者運(yùn)用物理機(jī)械力學(xué)加載BMSCs，通過模擬細(xì)胞在體內(nèi)微環(huán)境狀態(tài)，研究其調(diào)節(jié)作用[49]，結(jié)果表明各種物理性刺激均可影響B(tài)MSCs的生物學(xué)特性[50]。雖然實(shí)驗(yàn)方法與參數(shù)等設(shè)計(jì)各有不同，但仍可以得出一些共性點(diǎn)：適當(dāng)?shù)臓繌埩傲黧w剪切力對細(xì)胞產(chǎn)生的刺激不僅具有增殖效應(yīng)，且大部分可使其向成骨方向分化；靜壓力加載于BMSCs時，細(xì)胞增殖活性也顯著增強(qiáng)，對細(xì)胞產(chǎn)生的刺激大部分會使其向成軟骨方向、成脂方向分化；在生物力學(xué)加載過程中，PI3K、AKT、Wnt、BMP/Smad、RhoA、ERK等信號傳導(dǎo)通路對BMSCs的增殖、分化起著重要作用；但超過適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度刺激范圍時，對BMSCs自身的分化會產(chǎn)生抑制作用。目前國內(nèi)外學(xué)者不斷模擬細(xì)胞所在力學(xué)微環(huán)境，促進(jìn)了人們對力學(xué)微環(huán)境與BMSCs之間聯(lián)系的了解，但也不能僅僅使用獨(dú)立的因素研究機(jī)械因素和細(xì)胞之間的關(guān)系[51]。

此外，也仍有很多問題需進(jìn)一步探索。例如如何進(jìn)一步了解細(xì)胞感受機(jī)械信號傳導(dǎo)的機(jī)制；BMSCs在發(fā)育、疾病、創(chuàng)傷修復(fù)中如何感知復(fù)雜機(jī)械環(huán)境刺激等。隨著對BMSCs感受生物力學(xué)研究的深入，相信可以為BMSCs的組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究更好地應(yīng)用于臨床治療等提供參考，為治療應(yīng)力性骨折和骨質(zhì)疏松等疾病奠定理論基礎(chǔ)。