CRISPR/Cas9系統在魚類上的研究及應用進展

許丁凡 衛福磊

【摘? 要】CRISPR/Cas9 技術是一種由gRNA引導的Cas9核酸內切酶靶向編輯技術，已廣泛用于基因的敲除、敲入和敲降，其操作簡便快速，成本低，已成為人們探究基因功能、修復受損基因、沉默有害基因以及改良經濟物種種質性狀的重要工具。魚類是脊椎動物中最大的類群，許多物種對科學研究和水產養殖都有價值。這篇綜述著重介紹了新一代基因組編輯技術CRISPR/Cas9在魚類中的最新進展和應用，特別強調了它們在性別決定和生殖功能方面的應用。

【關鍵詞】CRISPR/Cas9;性別決定;疾病模型;水產養殖

引言

CRISPR/Cas9技術是一種由gRNA引導的Cas9核酸內切酶靶向編輯技術，已廣泛用于基因的敲除、敲入和敲降，已成為人們探究基因功能、修復受損基因、沉默有害基因以及改良經濟物種種質性狀的重要工具。基因組編輯是基因功能反向遺傳學研究的有力工具。魚類具有多種多樣的生殖方式，養殖的苗種主要靠人工繁殖，因此控制性別是水產養殖增加產量的有效途徑。還有其他的目的需要控制魚類的性別，性別控制技術在水產養殖中的一些種類得到了應用，它是建立在魚類性別決定與分化的生物學基礎上開展的。這些新出現的基因組編輯技術首次允許在包括高效魚類在內的多種物種中進行基因定位或編輯。盡管基因敲除已成為模式魚的主要反向遺傳途徑，但它往往存在特異性低、毒性高的問題。本文就CRISPR/Cas9在魚類中的研究進展和應用作一綜述，重點介紹它們在性別決定和生殖基因功能研究中的應用。

1.性別決定及其分子機制

魚類的雌雄個體在生長速度、個體大小、形態顏色方面具有明顯差異，掌握魚類性別決定和分化機制，可以調控魚類向某一單向性別發育，從而創造更多的經濟價值。許多養殖魚類生長具有明顯的性別二態性，尼羅羅非魚雄魚比雌魚生長快。研究中采用CRISP/Cas9對非模式生物羅非魚進行基因敲除，說明Dmrt基因對于精子的發育和成熟具有重要作用。類固醇生成因子I（SF-1/NR5A1），是核受體超家族中一個調控類固醇生成，對性腺發育，性別決定與分化不可缺少的轉錄因子。利用靶向基因敲除技術產生sf-1突變體，F0代導致性腺發育缺陷，肥滿度增加，甚至出現由雌向雄的性逆轉，為羅非魚的性別控制提供了理論依據。黃顙魚是我國一種重要的淡水經濟魚類，通過對XY和YY黃顙魚精巢進行了轉錄組比較分析，揭示了miR-141/429和靶基因相互作用在精巢發育和精子生成過程中發揮著重要作用。性或性腺分化是一個復雜的事件，其機制在硬骨魚類中尚不清楚。盡管其復雜性和可塑性，卵巢分化過程被認為涉及性腺芳香化酶。

2.魚類疾病模型的基因組編輯

斑馬魚有兩種形式的蛋白。最近利用CRISPR/Cas9在斑馬魚中對這兩個基因進行了突變，這兩個突變體表現出了人類癲癇的典型癥狀，使其成為研究疾病機制和開發治療方法的絕佳動物模型。最近的一項研究利用TALEN創建了一個馬賽克斑馬魚突變體，在部分體細胞中敲除了腫瘤抑制因子視網膜母細胞瘤1，導致腫瘤最早在3.5個月內發生，且多發生在大腦。骨質疏松癥是老年人的主要健康問題。全基因組關聯研究發現了大量骨質疏松癥的潛在遺傳因素，包括ATP6V1H，通過CRISPR/Cas9對斑馬魚ATP6V1H同源物進行突變，產生了一個突變體，表現出與人類骨質疏松癥相似的表型。用MMP9和MMP13的小分子抑制劑處理突變體魚，成功地挽救了atpovlh突變體的表型。這些研究證明了魚種和基因組編輯在人類疾病建模和治療開發方面的巨大潛力。

3.基因編輯技術在水產養殖中潛在應用

魚類的生殖發育一直是生命科學研究的重要研究課題之一，在品種改良上具有重要意義。盡管基因組編輯仍處于起步階段，但它將在水產養殖領域得到巨大的應用。許多在水產養殖中具有重要意義的性狀都可以成為基因組編輯改進的目標，包括生長和繁殖性能、抗病性、飼料轉化效率和對環境脅迫因素的耐受性。在水產養殖中，為了控制家魚和轉基因魚的逃逸，通常希望實現無菌化。研究表明，基因組編輯在水產養殖中應用于培育有價值性狀的新品種的潛力巨大。編碼黑色素產生酶酪氨酸酶的基因是該方法發展和評價的最初目標。CRISPR極大地提高了我們直接研究小魚中基因功能的能力，為AOP的驗證和開發提供了先進的方法。

4.結語

隨著基因組編輯在模型魚種和具有重要經濟意義的魚種中的高效應用，我們現在正進入一個時代，這些強大的技術將在廣泛的魚種中得到爆炸性的應用，以研究基因功能或創造具有特殊特性的新的轉基因染色體。基因組編輯在魚類模型中越來越受歡迎，部分原因是由于魚類物種的生物學和技術優勢。隨著這些技術在各種魚類模型上的成熟，預計它們將在水產養殖中找到更多的應用，用于改善具有經濟價值的性狀，如生長和抗病性，在環境科學中用于監測干擾特定生理事件和途徑的污染物，以及在生物醫學中用于疾病建模和藥物篩選。作為生物多樣性最豐富的脊椎動物群體，基因組編輯技術在魚類物種中的獲得和應用將為基因功能及其在脊椎動物中的進化提供巨大的信息和啟示。

通訊作者：衛福磊

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