A549細胞條件培養基對人骨髓間充質干細胞增殖和凋亡的影響

王璐璐，劉丹陽，李永濤，金海峰，姜楊，張善強，沈雷

1.齊齊哈爾醫學院解剖學教研室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.齊齊哈爾醫學院組織胚胎學教研室，黑龍江齊齊哈爾161006

肺癌患病率位居惡性腫瘤之前列，全世界每年大約有60萬人死于肺癌[1]。盡管手術、化學藥物治療或放射治療等不同治療策略被應用于臨床實踐，但是卻仍然無法阻止肺癌的進展[2]。肺癌組織內也含有肺癌干細胞[3]，并認為肺癌干細胞有可能來源于間充質干細胞（Mesenchymal stem cells,MSC）[4-5]，MSCs具有較強的歸巢特性可能是造成肺癌等腫瘤浸潤或發生轉移的因素之一[5-6]。關于肺癌微環境對MSC增殖等細胞生物學影響還需要深入研究。

趨化因子能夠與MSCs表面相應受體相互結合，促進細胞遷移歸巢能力的肽類家族[7]。白細胞介素-8（Interleukin-8,IL-8）與乳腺癌、結腸癌轉移和復發密切相關[8]。該實驗從趨化因子角度驗證肺癌A549細胞上清液對hBMSCs增殖和凋亡的影響，為抑制肺癌細胞增生提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞

人正常肺上皮BEAS-2B細胞、人肺癌A549細胞和人骨髓間充質干細胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSC）均購于美國ATCC公司。

1.2 主要試劑和儀器

人IL-8、Akt、P-Akt蛋白ELISA試劑盒購于美國R&D公司；MTT、二甲基亞砜（DMSO）購于美國Sigma公司；Annexin V-PI細胞凋亡試劑盒購自美國Hyclone公司。美國Bio-Rad公司的Bio-Rad 550酶標儀；美國BD公司FACSAriaⅡ型流式細胞儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養10%胎牛血清的DMEM培養基分別培養BEAS-2B細胞和A549細胞；hBMSCs用含10%胎牛血清的α-MEM培養基培養。

1.3.2 提取細胞上清液4×106 BEAS-2B細胞和A549細胞在37℃，5%CO2培養12 h后，800 rpm離心5 min，分別提取兩種細胞上清液，0.22μm濾器抽濾。

1.3.4 細胞分組BEAS-2B細胞和A549細胞上清液用含1%胎牛血清的α-MEM培養基按體積比1:4稀釋為條件培養基（Conditioned medium，CM）。以A549 CM和BEAS-2B CM培養hBMSCs分別為A549-CM組和BEAS-2B CM組。正常培養的hBMSCs為對照組。

1.3.4 MTT細胞增殖實驗0.8×104各組hBMSCs，分別加入各組條件培養基或正常培養基。37℃，5% CO2培養6 h后，加入5 g/L MTT溶液；37℃，5%CO2繼續培養4 h，再添加DMSO。Bio-Rad 550酶標儀于490 nm檢測細胞增殖吸光度（Absorbance value，A值）。

1.3.5 Annexin V-PI細胞凋亡實驗3.5×105各組hBMSCs用1.25% Annexin V-FITC溶液重懸孵育20 min；10 000 rpm離心5 min；0.01 mmol/L PBS清洗3次，1 min/次；再加入2% PI溶液，4℃孵育2 min，10 000 rpm離心5 min；取上清液，0.01 mmol/L PBS重懸。FACSAriaⅡ型流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.6 ELISA 5×105各組hBMSCs，加入RIPA細胞裂解液及1 mmol/L PMSF，4℃，10 000 rpm離心5 min；BCA法測定蛋白總濃度。使用人Akt、P-Akt的ELISA試劑盒檢測各種蛋白的含量。A549細胞上清液和BEAS-2B細胞上清液的IL-8蛋白含量使用人IL-8的ELISA試劑盒進行檢測。

1.4 統計方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗或方差分析；計數資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 A549細胞上清液促進hBMSCs增殖

對照組、BEAS-2B CM組和A549-CM組hBMSCs的A值分別為（0.97±0.19）、（1.01±0.09）、（1.79±0.13），差異有統計學意義（F=125.93，P＜0.01）。

圖1 A549細胞上清液對hBMSCs細胞凋亡的影響

2.2 A549細胞上清液抑制hBMSCs凋亡

對照組、BEAS-2B CM組、A549-CM組hBMSCs的凋亡率分別為10.81%、9.31%和6.05%，差異有統計學意義（χ2=15.75，P＜0.01）。A549-CM組hBMSCs的凋亡率分別是對照組的0.56倍和0.65倍，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖1。

2.3 A549和BEAS-2B細胞上清液中IL-8蛋白的含量

ELISA實驗發現，A549細胞上清液中IL-8含量是（18.16±2.23）μg/mL，BEAS-2B細胞上清液IL-8含量是（10.07±1.55）μg/mL，差異有統計學意義（t=14.510，P＜0.01）。

2.4 A549細胞上清液促進hBMSCs的Akt、p-Akt蛋白表達

對照組、BEAS-2B CM組、A549-CM組Akt、p-Akt蛋白含量比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。A549-CM組hBMSCs的Akt、p-Akt蛋白含量均比對照組和BEAS-2B CM組升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 A549細胞上清液對hBMSCs中Akt、p-Akt蛋白含量的影響比較[（±s），μg/mL]

表1 A549細胞上清液對hBMSCs中Akt、p-Akt蛋白含量的影響比較[（±s），μg/mL]

注：與對照組比較，#P＜0.01；與BEAS-2B-CM組比較，*P＜0.01

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3 討論

間充質干細胞與其微環境內的宿主細胞相互影響。王志紅等[9]為探討MSC歸巢到電離輻射損傷的小鼠組織，將BALB/c小鼠經1.75 Gy X線進行全身照射4周，制備電離輻射誘發的胸腺組織損傷動物模型，并由小鼠尾靜脈注入MSCs。結果發現照射組小鼠第1天MSCs即可出現在損傷胸腺組織內，第10天MSCs在放射胸腺組織內大量分布。MSC是腫瘤微環境的組成部分，但是惡性腫瘤組織招募MSCs的機制還不清楚。研究發現MSC誘導胃癌HGC27細胞遷移和侵襲，MSC尚可增加胃癌細胞Snail間質標志物表達，降低N-cadherin、E-cadherin上皮標志物表達，HGC27細胞與MSC聯合培養能夠增強胃癌細胞的干性，這為MSC在胃癌中的作用提供了新的證據，也為提高MSC靶向治療胃癌的效率提供了機會[10]。

該實驗模擬腫瘤微環境對MSCs增殖或凋亡的影響，對非小細胞肺癌A549細胞與骨髓間充質干細胞之間的關系展開研究。相對于對照組、BEAS-2B CM組的A值（0.97±0.19）、（1.01±0.09），A549-CM組hBMSCs細胞A值為（1.79±0.13），說明A549-CM組hBMSCs細胞增殖非常明顯。但是3組細胞的凋亡率相比，A549-CM組hBMSCs細胞凋亡率約為5.64%，呈現顯著降低趨勢。Li W研究發現A549細胞在常氧條件下分泌HIF-1α蛋白，維持腫瘤生長和遷移，A549細胞Transwell遷移率約為89.26%，若以HIF-1 miRNA轉染A549細胞抑制HIF-1α表達，則出現HIF-1α沉默顯著抑制A549細胞遷移的情況，此時Transwell遷移率約為51.43%，提示A549惡性腫瘤細胞能夠分泌促進腫瘤自身生長的HIF-1α細胞因子[11]。該實驗發現A549細胞上清液中IL-8含量為（18.16±2.23）μg/mL，明顯高于BEAS-2B-CM組上清液IL-8含量（10.07±1.55）μg/mL。國內學者李林等[12]在慢性阻塞性肺疾病（COPD）合并肺癌患者血清中也發現，41例COPD合并肺癌患者組血清內的IL-6、IL-8和TNF-α分別為（186.73±0.92）ng/L、（298.28±27.81）ng/L和（147.51±2.32）ng/L；41例單純COPD組患者血清內IL-6、IL-8和TNF-α含量（20.92±22.67）、（45.47±15.94）、（86.04±1.05）ng/L，兩組IL-6、IL-8和TNF-α指標分別比較發現COPD合并肺癌患者組血清內IL-6、IL-8和TNF-α含量比單純COPD組明顯高表達。由此可見，該實驗的研究結果與李林等學者的研究結果相類似，即相對于單純COPD細胞或正常肺上皮細胞，肺癌細胞能夠高表達的IL-8細胞因子能夠更好維持腫瘤細胞生長。可見IL-8等活性因子對促進腫瘤等細胞自身增殖，維持自我更新起到積極作用。

IL-8能夠激活細胞內Akt-STAT3信號通路，啟動微絲微管收縮而促進脂肪或骨髓源MSCs遷移[13-14]。IL-8與卵巢癌、前列腺癌等惡性腫瘤的分級分期密切相關，IL-8與腫瘤發生淋巴結轉移（淋巴管新生）、血管轉移（血管新生）呈現正向關系[15-16]，提示從趨化因子角度闡明非小細胞肺癌微環境對MSC的影響會有新發現。該實驗ELISA試驗證實A549細胞上清液中IL-8蛋白含量明顯高于正常肺BEAS-2B細胞組，進一步說明A549細胞可以表達IL-8蛋白等趨化因子[12]。IL-8蛋白能夠與MSCs表面的CXCR1/2受體特異結合，活化細胞遷移過程[13-14,17]。BEAS-2B-CM組hBMSCs的A值或細胞凋亡率與對照組無顯著性差異的原因可能是由于正常人肺細胞BEAS-2B所表達的活性物質較少，在接下來的ELISA實驗中也證實了BEAS-2B上清液中IL-8含量比非小細胞肺癌A549上清液IL-8含量低。實驗發現，A549-CM組hBMSCs的Akt、p-Akt蛋白表達明顯上調，這與學者研究發現的IL-8蛋白或IL-8受體活化后，能夠促進晶狀體上皮細胞等細胞遷移相類似[13,18]。Akt信號通路與很多已知調控細胞運動的Notch、Wnt等信號通路還諸多交叉作用[19-20]。關于A549細胞分泌的其他活性因子成分以及對MSCs的影響，還需要繼續利用高效液相色譜技術、基因組學、動物實驗等技術進行深入研究和驗證。