小續命湯改善心肺復蘇后大鼠神經功能及腦保護作用*

周生花，李華，郭燕可，張國妮

（1.河南中醫藥大學第二附屬醫院，鄭州 450046；2.安陽市中醫院，安陽 455000）

心臟驟停是院外卒死的主要原因。據報道心臟驟?；颊咧袃H24.4%接受了心肺復蘇，接受心肺復蘇患者中僅5%可恢復自主循環，而精神功能良好患者出院率僅1%[1]。因此，該病嚴重威脅人類生命與健康。雖然目前已有標準心肺復蘇流程用于積極治療心臟驟停，但是心臟驟停后腦組織血管灌流停滯引發的腦損傷仍是患者死亡的主要原因[2]。目前臨床治療心臟驟停引起的腦損傷主要有鈣通道阻滯劑、抗氧化劑、糖皮質激素等藥物，但此類藥物均非腦損傷治療特效藥，療效并不能令人滿意[3]。因此如何防治心肺復蘇后腦損傷仍需要進一步研究。

小續命湯主要成分有防風、麻黃、桂枝、人參等，是治療缺血性腦卒中的傳統藥方。有研究表明，小續命湯可減輕腦缺血大鼠腦損傷，具有腦神經保護作用[4]。但是小續命湯對在心肺復蘇后大鼠腦損傷是否有療效相關報道較少。據報道，氧化應激在心肺復蘇后腦損傷過程中發揮重要作用[5]。胞漿蛋白伴侶分子（Keap1）-核因子 E2相關因子（Nrf2）/血紅素氧合酶1（HO-1）是機體重要內源性抗氧化通路，參與腦組織抗氧化應激反應[6]。有研究表明，小續命湯可抑制腦缺血大鼠氧化應激反應，減輕腦損傷[7]。但是小續命湯是否影響Keap1-Nrf2/HO-1信號通路發揮療效相關研究較少。因此探究小續命湯對心肺復蘇后大鼠腦保護作用及對Keap1-Nrf2/HO-1通路的影響具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 63只7～9周齡無特定病原體（SPF）級SD雄鼠，體質量200～250 g，購自上海靈暢生物科技有限公司，許可證號：生產許可SCXK（滬）2018-0003；小續命湯有效成分組粉末購自中國醫學科學院藥物研究所篩選中心；二甲基亞砜（DMSO）、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京Solarbio公司，大鼠腦組織氧化應激指標脂質過氧化物丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）檢測酶聯免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒購自上酶聯生物科技有限公司；熒光定量預混液購自北京諾貝萊生物科技有限公司；引物合成委托武漢金開瑞公司；鼠 Keap1、Nrf2、HO-1、內參（β-actin）一抗和兔抗鼠二抗均購自美國Abcam公司。

RM-6240BD多通道生理信號采集系統購自成都儀器廠；CPT-100D探針溫度計購自四川成都泰盟儀器公司；ALC-V8S小動物呼吸機購自上海奧爾科特生物技術有限公司；KWD-808Ⅱ電針儀購自常州市武進長城醫療器械有限公司；Synergy2酶標儀購自美國Biotek公司；TGL-20M高速冷凍離心機購自山東科博科學儀器有限公司；LightCycler 96實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀購自美國羅氏公司。

1.2 實驗方法 將63只SPF級SD雄鼠按照隨機數字表法隨機分為對照組（8只）和建模組（55只），建模組大鼠均按照如下方法建立心肺復蘇模型：使用10%水合氯醛麻醉大鼠，分離大鼠股動脈和股靜脈，選取約1 cm長度結扎阻斷血流，并分別插入股動脈導管和股靜脈導管。導管結三通轉換器，連接在壓力傳感器上，可通過多通道生理信號采集系統觀察動脈波形。將大鼠氣管插管后接連小動物呼吸機。在大鼠四肢皮下采集信號檢測大鼠Ⅱ導聯心電圖。使用經皮心外膜電刺激法建立大鼠心臟驟停動物模型[8]。當動脈血壓在電刺激10 s后迅速下降至25 mm Hg（1 mm Hg≈0．133 kPa，下同）以下，且血壓波形接近直線，或暫停電刺激后心電圖表現出心室顫動、心搏停止，則判定為心臟驟停。大鼠出現心臟驟停后，持續電刺激3 min后停止電刺激和特殊干預。觀察3 min，觀察期間若大鼠自主恢復心率且平均動脈壓高于25 mm Hg，則認為建模失敗。將心臟驟停建模成功的大鼠進行常規心肺復蘇，待大鼠心率恢復竇性心律，動脈壓高于60 mm Hg并維持10 min以上則認為大鼠恢復自主循環。若胸外按壓及機械通氣時長超過10 min大鼠仍未恢復自主循環，則認為心肺復蘇失敗。將建模成功的大鼠隨機分為5組，小續命湯高、中、低劑量組、二甲基亞砜（DMSO）組和模型組。余下8只大鼠記作對照組，如上述進行手術操作但不進行電刺激致心臟驟停和心肺復蘇。大鼠心肺復蘇后10 min，小續命湯高、中、低劑量組灌胃300、150、75mg/kg小續命湯。DMSO組灌胃100mg/kg的DMSO。連續治療7 d后，觀察以下指標。

大鼠神經功能評分：分別在治療前后對大鼠神經功能進行評分。評分細則見表1。

表1 大鼠神經功能評分標準Tab.1 Neurological function score standard of rats

大鼠腦海馬組織病理學觀察：通過HE染色觀察大鼠腦海馬組織病理變化。斷頭法處死大鼠后，取大鼠腦海馬組織，4%多聚甲醛固定過夜后，進行石蠟包埋。將組織蠟塊切成厚度為4 μm切片，經過脫蠟、復水后按照HE染色試劑盒進行染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明化處理后封片，在光學顯微鏡下觀察。

大鼠腦海馬組織中氧化應激生化指標檢測：通過ELISA檢測大鼠腦海馬組織中MDA和SOD濃度。取大鼠腦海馬組織，加少許液氮研磨勻漿，1 000×g離心10 min后取上清液。設置標準品孔和樣品孔按照ELISA試劑盒操作步驟操作。加入終止液后，立即在450 nm波長處讀出各孔光吸收（OD）值，根據標準孔OD值與蛋白濃度繪制標準曲線，并依照OD值計算各樣本孔蛋白濃度。

大鼠腦海馬組織中Keap1、Nrf2和HO-1信使核糖核酸（mRNA）表達檢測：通過RT-qPCR檢測大鼠腦海馬組織中Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA表達水平。取大鼠腦海馬組織研磨勻漿，加入Trizol提取組織總核糖核酸（RNA），并反轉錄為互補的脫氧核糖核酸（cDNA）。從美國國家生物信息中心（NCBI）上查找Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA序列并設計上下游引物，Keap1上游引物為：5’-TTAGGATGCCTCGAATAGCAT-3’，下游引物為：5’-TGCTTTCGCAATCGTAGACC-3’，產物長度 122 bp，Nrf2 上游引物為：5’-GATGCTTCCAGATACGATAAC-3’，下游引物為：5’-CTTACAATCCAGGTAGCAAT-3’，產物長度為 103 bp，HO-1 上游引物為：5’-GTCTCCTAGAGGCTTACAAG-3’，下游引物為：5’-TGTCGCAACTTAGCTACGATCA-3’，產物長度為119 bp。持家基因β-actin上游引物為：5’-AGAGCTTGATTACGAAGTAG-3’，下游引物為：5’-TCCTCAATGGATGACGTAGAC-3’，產物長度為121 bp。退火溫度56 bp，40 個循環。按照 2-ΔΔCt計算 Keap1、Nrf2 和 HO-1 mRNA相對表達量。

大鼠腦海馬組織Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達水平：通過蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測大鼠腦海馬組織Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達水平。取大鼠腦海馬組織加少許液氮研磨勻漿，加入細胞裂解液提取組織總蛋白。進行蛋白凝膠電泳。轉膜，使用5% BSA封閉室溫封閉2 h后，加一抗4℃孵育過夜，更換二抗室溫孵育2 h，顯色。分析條帶灰度值并以β-actin為內參，分析Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 通過SPSS 23.0進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多樣本間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較使用SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠神經功能評分 55只建模大鼠建立心臟驟停動物模型均建模成功，心肺復蘇過程中有41只成功回復自助循環，其中14只大鼠均復蘇失敗。在治療期間，又出現了模型組、小續命湯高劑量組各1只大鼠死亡，推測其原因可能與復蘇后心肺功能不全有關。大鼠分組情況為：對照組8只，模型組9只，DMSO組、小續命湯高、中、低劑量組各8只。

大鼠神經功能評分DMSO組、小續命湯高、中、低劑量組均低于治療前（P＜0.05），治療前模型組、DMSO組、小續命湯高、中、低劑量組均高于對照組（P＜0.05）。治療后，模型組高于對照組（P＜0.05），DMSO組和小續命湯高、中、低劑量組均低于模型組（P＜0.05），小續命湯高、中劑量組均低于DMSO組（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠治療前后神經功能評分（±s）Tab.2 Neurological function scores of rats in groups before and after treatment（±s）

表2 各組大鼠治療前后神經功能評分（±s）Tab.2 Neurological function scores of rats in groups before and after treatment（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 DMSO組比較，△P＜0.05；與治療前比較，▲P＜0.05。

組別 動物數 評分（分）治療前 治療后對照組 8 - -模型組 9 33.56±3.68* 30.77±5.67*DMSO 組 8 34.63±4.32* 10.50±4.54#▲小續命湯高劑量組 8 34.38±3.14* 7.63±2.78#△▲小續命湯中劑量組 8 33.87±2.99* 10.75±3.16#△▲小續命湯低劑量組 8 33.00±4.03* 18.75±3.32#▲

2.2 大鼠腦海馬區組織病理學觀察 對照組腦海馬區組織神經元排列緊密且整齊，形態正常，無明顯病變。模型組可見神經元排列稀疏且凌亂，神經元出現明顯水腫，細胞核腫脹，胞漿空泡樣變。DMSO組、小續命湯高、中、低劑量組病變均出現好轉，見圖1。

圖1 治療后大鼠腦海馬區病理學觀察（HE，×200）Fig.1 Pathological observation of hippocampus tissues in groups after treatment（HE，× 200）

2.3 大鼠腦海馬組織中氧化應激生化指標檢測 大鼠腦海馬組織MDA含量模型組高于對照組（P＜0.05），DMSO組和小續命湯高、中、低劑量組均低于模型組（P＜0.05），小續命湯高、中劑量組均低于DMSO組（P＜0.05）；SOD 含量模型組低于對照組（P＜0.05），DMSO組和小續命湯高、中、低劑量組均高于模型組（P＜0.05），小續命湯高、中劑量組均高于DMSO組（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠治療后腦海馬組織中氧化應激生化指標檢測（±s）Tab.3 Biochemical indexes of oxidativestress in hippocampus of rats in groups after treatment（±s）

表3 各組大鼠治療后腦海馬組織中氧化應激生化指標檢測（±s）Tab.3 Biochemical indexes of oxidativestress in hippocampus of rats in groups after treatment（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 DMSO組比較，△P＜0.05。

組別 動物數 MDA（nmol/mg） SOD（U/mg）對照組 8 5.97±0.31 206.58±10.65模型組 9 9.35±0.36* 134.35±12.56*DMSO 組 8 8.36±0.49# 161.89±10.71#小續命湯高劑量組 8 6.71±0.34#△ 192.62±16.58#△小續命湯中劑量組 8 7.79±0.39#△ 173.90±14.22#△小續命湯低劑量組 8 8.46±0.42# 158.18±9.49#

2.4 大鼠腦海馬組織中 Keap1、Nrf2和 HO-1 mRNA相對表達量檢測 Keap1 mRNA相對表達量模型組低于對照組（P＜0.05），DMSO組和小續命湯高、中、低劑量組均低于模型組（P＜0.05），小續命湯高、中劑量組均低于DMSO組（P＜0.05）；Nrf2和HO-1 mRNA相對表達量模型組高于對照組（P＜0.05），DMSO組、小續命湯高、中、低劑量組均高于模型組（P＜0.05），小續命湯高、中劑量組均高于DMSO組（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠治療后腦海馬組織中Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA 相對表達量（±s）Tab.4 Relative expressions of Keap1，Nrf2 and HO-1 mRNA in hippocampus of rats in groups after treatment（±s）

表4 各組大鼠治療后腦海馬組織中Keap1、Nrf2和HO-1 mRNA 相對表達量（±s）Tab.4 Relative expressions of Keap1，Nrf2 and HO-1 mRNA in hippocampus of rats in groups after treatment（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 DMSO組比較，△P＜0.05。

組別 動物數 Keap1 Nrf2 HO-1對照組 8 1.22±0.14 0.48±0.06 0.59±0.08模型組 9 0.97±0.12* 0.68±0.11* 0.74±0.09*DMSO 組 8 0.83±0.09# 0.74±0.12# 0.87±0.10#小續命湯高劑量組 8 0.49±0.08#△ 1.33±0.18#△ 1.88±0.13#△小續命湯中劑量組 8 0.73±0.11#△ 1.01±0.14#△ 1.41±0.12#△小續命湯低劑量組 8 0.85±0.13# 0.78±0.10# 0.92±0.15#

2.5 大鼠腦海馬組織Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達水平 Keap1蛋白表達水平模型組低于對照組（P＜0.05），DMSO組和小續命湯高、中、低劑量組均低于模型組（P＜0.05），小續命湯高、中劑量組均低于DMSO組（P＜0.05）；Nrf2和HO-1蛋白表達水平模型組高于對照組（P＜0.05），DMSO組、小續命湯高、中、低劑量組均高于模型組（P＜0.05），小續命湯高、中劑量組均高于DMSO組（P＜0.05），見圖2、表5。

圖2 大鼠腦海馬組織Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達檢測Fig.2 Protein expressions of Keap1，Nrf2 and HO-1 in rat hippocampus

表5 各組大鼠治療后腦海馬組織Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相對表達量（±s）Tab.5 Relative expressions of Keap1，Nrf2 and HO-1 proteins in hippocampus of rats in groups after treatment（±s）

表5 各組大鼠治療后腦海馬組織Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相對表達量（±s）Tab.5 Relative expressions of Keap1，Nrf2 and HO-1 proteins in hippocampus of rats in groups after treatment（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與 DMSO組比較，△P＜0.05。

組別 動物數 Keap1 Nrf2 HO-1對照組 8 0.82±0.12 0.33±0.05 0.74±0.15模型組 9 0.70±0.09* 0.59±0.07* 0.97±0.14*DMSO 組 8 0.63±0.08# 0.71±0.10# 1.19±0.17#小續命湯高劑量組 8 0.32±0.05#△ 1.14±0.17#△ 2.10±0.09#△小續命湯中劑量組 8 0.48±0.06#△ 0.89±0.12#△ 1.65±0.14#△小續命湯低劑量組 8 0.60±0.08# 0.68±0.09# 1.22±0.11#

3 討論

心跳驟停心肺復蘇成功患者中常出現預后不良，主要表現為認知障礙、運動障礙、甚至植物狀態等神經系統功能異常，對患者及社會帶來巨大負擔[9]。心肺復蘇后患者腦保護的重要性逐漸被重視。心臟驟停后心肺復蘇所引起的腦損傷與腦缺血再灌注有關[10]。心臟驟停后，腦血流中斷導致腦組織出現缺血缺氧癥狀并產生大量氧自由基，心肺復蘇血流再灌注后，氧自由基會引起嚴重腦損傷[11]。雖然隨著技術的提高，心肺復蘇成功率逐漸提升，但針對心肺復蘇后腦損傷的治療相關藥物較少[12]。有研究指出DMSO有腦保護作用，對心肺復蘇后腦損傷有一定的防治效果，但是效果仍難以滿意[13]。故而本研究選用DMSO作為陽性對照藥物。

中醫認為患者因各種原因引起心跳和呼吸驟停，則為病邪直入腦府，圍困腦神，腦絡瘀滯，腦髓失養，腦神萎頓，進而腦髓腦絡失其主宰，導致功能障礙。治療要以虛實辨證為核心，以開閉醒神為方法，補虛益氣，回陽固脫[14]。

小續命湯成分有防風、麻黃、桂枝、人參、附子、杏仁、生姜、川芎、芍藥、黃芩、防己、甘草。防風可祛風解表，止痙；麻黃可發汗解表，宣肺平喘。桂枝可調和營衛，溫經活血、溫陽化氣、平沖降逆；人參可大補元氣，復脈固脫、安神益智。附子可回陽救逆，補火助陽；杏仁可止降氣止咳，平喘潤肺；生姜可活血驅寒，回陽通脈；川芎可活血通脈，行氣止痛；芍藥可養血和營，緩急止痛；黃芩可清熱解毒，瀉火燥濕；防己可祛風止痛，利水消腫；甘草可清熱解毒，緩急止痛；諸藥聯用可溫經通陽，扶正祛風[15]。

有研究表明，小續命湯可通過保護線粒體完整性，抑制神經元凋亡對腦缺血再灌注大腦神經元起保護作用[16]。其中人參皂苷、桂枝、甘草酸二銨等中藥成分均可對腦缺血損傷有治療效果[17-19]。據報道小續命湯可顯著降低大鼠缺血腦組織中MDA含量和提高SOD活性，減輕缺血腦組織氧化應激損傷[20]。本研究結果顯示，心肺復蘇大鼠腦組織MDA濃度升高而SOD含量減少，經過小續命湯治療后，MDA濃度降低而SOD升高，與上述報道結果一致，表明小續命湯可減輕心肺復蘇大鼠腦氧化應激損傷。此外神經功能評分和HE染色觀察發現，小續命湯還可提高大鼠神經功能，減輕大鼠腦病理損傷。本研究中小續命湯低劑量組的腦保護作用與DMSO組相近，而小續命湯中劑量組、高劑量組的腦保護作用均優于DMSO組，表明DMSO和小續命湯均對心肺復蘇大鼠有腦保護作用，但小續命湯的作用呈劑量依賴性，且中、高劑量的小續命湯作用優于DMSO，提示小續命湯在心肺復蘇患者中可能具有理想的腦保護作用，有望在臨床中推廣應用。

氧化應激是導致腦缺血損傷的重要因素，Keap1-Nrf2/HO-1信號通路是機體內源性抗氧化途徑，發揮重要抗氧化應激作用[21-22]。Keap1是一種阻遏蛋白，可負性調節Nrf2。在正常生理狀態下，Keap1和Nrf2結合，當機體出現氧化應激反應，產生的大量活性氧可導致Keap1空間結構改變，進而與Nrf2分離[23]。游離的Nrf2可調控下游HO-1表達，HO-1是一種抗氧化蛋白酶，與腦缺血損傷密切相關[24]。有研究表明，敲除HO-1基因的小鼠在腦缺血時受到的腦損傷較野生型小鼠比更嚴重[25]。本研究結果發現，心肺復蘇模型組大鼠腦組織中Keap1 mRNA和蛋白水平與對照組比較均降低，Nrf2和OH-1mRNA和蛋白水平與對照組比較均出現升高，推測可能與機體出現氧化應激反應激活自身抗氧化保護機制，減少Keap1對Nrf2的抑制，進而刺激Nrf2和OH-1的表達，但這種內源性上調HO-1不能對抗腦氧化應激反應引起的腦損傷。而使用小續命湯治療后，Keap1表達顯著低于模型小鼠，Nrf2和OH-1表達顯著高于模型小鼠，由此推測，小續命湯可通過激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路抗氧化作用，減輕心肺復蘇后大鼠腦損傷。

綜上所述，小續命湯可改善心肺復蘇后大鼠神經功能，減輕大鼠腦損傷，抑制氧化應激反應，推測其機制可能與激活Keap1-Nrf2/HO-1信號通路，下調Keap1 mRNA和蛋白表達水平，上調Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表達水平有關。本研究僅從氧化應激的角度分析小續命湯的藥理作用，小續命湯是否影響其他信號通路本研究尚未涉及，因此有待進一步研究。