藿苓益智方對阿爾茨海默病模型小鼠神經細胞凋亡線粒體通路的作用研究

吳 鵬，邢俊娥，曹凌群，李少琳，熊 赟

(1.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)，又稱老年癡呆病，是一種最常見的中樞神經系統退行性疾病，隨著疾病的不斷發展嚴重危害著患者的身心健康，是癡呆病中最常見類型[1]。AD在臨床上最特征的表現為：進行性的記憶力減退、認知功能障礙和人格改變等。隨著我國人口老齡化，AD的發病率有逐年提高的趨勢[2]。該病病因迄今不明、發病機制也較為復雜，目前研究尚未證實其特定的有效作用機制，主要是以一些假說為主，包括：β淀粉樣蛋白(Amyloid β,Aβ)瀑布假說、Tau蛋白假說、基因突變及線粒體功能障礙假說、炎性機制和氧化應激假說等，在上述假說中線粒體功能障礙在AD的早期改變中最具有特征性，可能是今后一段時間研究的熱點和治療的靶點[3-6]。本課題基于“線粒體障礙假說”發病機制出發，應用多年的臨床經驗方藿苓益智方探討AD小鼠腦內線粒體通路神經細胞凋亡的調控作用，具體的實驗方法和結果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：健康雄性SPF級SD小鼠100只，體重：(150±45)g，鼠齡：1～2個月，動物由廣西中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號:SCXK(桂)2005-0003。對所有動物的處置完全符合2006年由科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.1.2 藥物及試劑：藿苓益智方由茯苓、刺五加、淫羊藿、山藥4味中藥組成，由我院藥劑科統一采購，并按照藿苓益智方的比例和提取工藝進行提取，濃縮，干燥，備用。鹽酸多奈哌齊片[衛材(中國)有限公司制造，國藥準字H20070181]。Aβ25-35由北京博奧森生物技術有限公司提供。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒由美國Genzyme公司提供。四甲基偶氮唑鹽(MTT)由河北博海生物工程公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法：采用Aβ的活性片段Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡建立AD的細胞模型PC12細胞。用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的雙抗配成一定比例的DMEM培養基，后進行分裝封口處理，培養基置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的CO2培養箱中培養。每4～5 d進行1次細胞傳代，傳代時取對數生長期的細胞，用0.25胰酶將其加入到培養瓶中，輕微搖動培養瓶讓培養基細胞充分和胰酶接觸，然后再次放入培養箱約2 min后取出，在顯微鏡下觀察細胞突起開始收縮變圓時重新加入含血清的培養基中終止細胞消化，移液槍完全將細胞吹散，收集細胞液離心，離心后重新加入新鮮的培養基吹打成細胞懸液，然后將細胞懸液倒入15 ml離心管中，1000 r/min離心10 min去除上清液，將新鮮培養基重懸細胞后接種于96孔培養板中，24 h后再次除去舊的培養基，加入不含血清的Aβ25-35培養基繼續在CO2培養箱中培養24 h后用于各項指標檢測。

1.2.2 動物分組：本實驗設置六組，即對照組、Aβ25-35組、Aβ25-35+鹽酸多奈哌齊組、Aβ25-35+藿苓益智方提取物低劑量組(50 μg/ml)、藿苓益智方提取物中劑量組(100 μg/ml)、藿苓益智方提取物高劑量組(200 μg/ml)。對照組：DMEM培養基中培養48 h；Aβ25-35組：先在DMEM培養基中培養24 h，然后換成含有20 μmol/L Aβ25-35的DMEM培養基繼續培養24 h；Aβ25-35+正常血清組：正常血清預處理24 h后加入20 μmol/L Aβ25-35的DMEM培養基繼續培養24 h；Aβ25-35+鹽酸多奈哌齊組、Aβ25-35+藿苓益智方提取物組預處理24 h后加入20 μmol/L Aβ25-35的DMEM培養基繼續培養24 h。

1.3 細胞存活率測定 采用MTT法檢測各組細胞存活率，觀察藿苓益智方提取物對Aβ25-35誘導的神經細胞活性的影響。收集PC12細胞，按1.2.2所示的方法分組培養并處理細胞，根據測得的吸光度值(OD值)，來判斷活細胞數量，OD值越大，細胞活性越強。

1.4 凋亡定量檢測 采用流式細胞儀，Annexin V/PI雙染法檢測各組神經細胞凋亡數量。收集 PC12細胞，按1.2.2所示的方法分組培養并處理細胞，培養結束后，離心收集細胞于離心管內，孵育緩沖液洗滌1次，離心5 min棄上清液，加入100 μl Binding Buffer懸浮細胞，室溫下孵育20 min，然后再進行離心沖洗，最后加入10 μl Annexin V-FITC和Propidium Iodid混勻，4 ℃避光反應20 min，并不時振動，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5 線粒體超微結構檢測 采用Hoechst 33342染色，透射電鏡檢測各組神經細胞線粒體超微結構變化。收集PC12細胞，按1.2.2所示的方法分組培養并處理細胞，培養結束后，用倒置熒光顯微鏡對各組細胞進行形態學觀察分析。

2 結 果

2.1 細胞存活率測定結果 本實驗采用MTT法檢測藿苓益智方提取物(50、100、200 μg/ml)以及鹽酸多奈哌齊片對PC12細胞活性的影響。結果如圖1所示，Aβ25-35組與對照組相比較細胞存活率顯著降低(P<0.01)；藿苓益智方提取物50 μg/ml組的細胞存活率與Aβ25-35組相比有一定的增高(P<0.05)；鹽酸多奈哌齊組和藿苓益智方提取物(100、200 μg/ml)與Aβ25-35組相比，細胞存活率顯著升高(均P<0.01)，但藿苓益智方提取物200 μg/ml升高的更明顯。

2.2 凋亡的定量檢測結果 本研究利用流式細胞儀、Annexin V/PI雙染法對PC12細胞的凋亡情況進行了定量分析。實驗結果如圖2所示，對照組細胞幾乎完好無損、Aβ25-35組細胞凋亡率則顯著升高(38.1%)。藿苓益智方低、中、高劑量+Aβ25-35組細胞凋亡率則逐步下降至23.8%、16.2%、7.4%，鹽酸多奈哌齊組下降至7.3%，與Aβ25-35組相比均具有統計學差異。以上研究結果提示：藿苓益智方中、高劑量組能夠有效地抑制Aβ25-35對PC12細胞的損害，能有效地對神經細胞起到保護作用。

注： 與對照組比較，*P<0.01；與Aβ25-35組比較，△P<0.05，#P<0.01

2.3 線粒體超微結構檢測 線粒體超微結構檢測結果如圖3所示，經Hoechst 33342染色后，對照組細胞核均勻淡染呈圓形低強度藍色熒光，邊緣清晰；而Aβ25-35組細胞核出現較多深染固縮、核濃縮、不規則以及裂解的現象，凋亡細胞數目明顯增加，呈現凋亡的典型特征。與Aβ25-35組，鹽酸多奈哌齊組細胞凋亡的數目下降明顯，同時藿苓益智方低、中、高劑量+Aβ25-35組上述現象在逐步緩解，細胞凋亡數目均有所減少，且呈劑量依賴性趨勢，表明藿苓益智方對Aβ誘導的PC12細胞凋亡具有明顯的抑制作用。

注：與對照組比較，*P<0.01；與Aβ25-35組比較，△P<0.05，#P<0.01

圖3 各組細胞線粒體超微結構(HE染色，×400)

3 討 論

AD是一個復雜的多因素綜合病癥,中醫藥尤其復方中藥在治療AD方面具有一定優勢，往往可以很好的起到多靶點調控的作用。通過我們十多年來的研究發現AD患者不僅在認知障礙，而且大部分患者有人格和情感障礙，同時臨床上很多患者都有納差，大便溏等情況，這些臨床表現特征符合脾腎虧虛及心神不定的表現，同時研究發現中醫的“脾主運化”與線粒體能量生成存在也密切聯系[7-10]，因此，我們提出了AD治療當以補腎健脾、安神益智為主。

根據上述理論我們研制出中藥驗方藿苓益智方，該方主要組成：刺五加、淫羊霍、茯苓、山藥等。其中淫羊藿具有補腎壯陽，益精安神作用，既可溫腎補陽、又可暖脾土，陳仕檢等[11]應用淫羊藿苷對AD大鼠模型干預后發現可改善AD的癥狀。茯苓有寧心、健脾、利水滲濕的作用，脾的健運功能正常則痰濁不生，瘀血不滯，血脈能正常運行。研究顯示茯苓多糖主要通過抑制腦內乙酰膽堿酯酶合成，從而提高乙酰膽堿活性以起到改善學習記憶[12]。刺五加在《本草綱目》中被描述為“本經上品”，研究發現[13]具有補氣、抗衰老、抗疲勞、強意志的功能，楊坦等[14]研究發現刺五加皂苷能明顯改善衰老大鼠的學習記憶功能。山藥，性平穩，具有補脾養胃、益肺生津、補腎澀精的功效，具有抗氧化、抗衰老等藥理作用。上述藥相輔相成，補腎健脾，延緩衰老。

本實驗提示藿苓益智方對AD的治療中可對Aβ誘導的PC12細胞凋亡具有明顯的抑制作用，改善細胞存活率，減少線粒體細胞凋亡。人體的細胞中幾乎都存在著線粒體，線粒體作為細胞的動力站能源源不斷產生能量，為細胞的生命活動提供大約95%的能量[15-16]。我們通過查閱文獻發現線粒體異常是AD病理的早期特征[17]。AD患者腦內出現大量神經元丟失的重要原因之一是神經細胞的凋亡[18]，細胞凋亡是機體組織為了清除衰老或受損細胞的自我保護的一種方式，凋亡信號的不同在細胞中也同樣引發不同的凋亡轉導通路，其中本課題研究的線粒體通路是細胞凋亡的內源性通路，實驗研究表明在細胞凋亡調控活動中線粒體占據著中心的地位，其在凋亡程序化死亡信號傳導途徑中起關鍵的調節作用[19-20]。通過本實驗我們發現：藿苓益智方可提高細胞存活率，減少細胞凋亡，同時能夠有效地抑制Aβ25-35對PC12細胞的毒性，阻止并延緩AD的進展。