燥邪對健康大鼠氣管和肺內細小支氣管黏膜組織肺泡表面活性物質相關蛋白-D表達的影響

劉姍姍，王麗鑫，張旺旺，史 紅

(新疆醫科大學中醫學院,新疆 烏魯木齊 830000)

燥邪為中醫外感六淫邪氣之一，具有“燥性干澀，易傷津液”等致病特點。我國以新疆為代表的西北部地區，地處沙漠邊緣，干旱半干旱是其特有的氣候特征。有研究指出，我國西北“燥發無時，非獨秋有，燥氣偏盛”，其民常罹患西北燥證而變生他疾[1]。肺泡表面活性物質(Pulmonary surfactant,PS)相關蛋白(Suractant-associated protein,SP)中的蛋白-D(SP-D)是肺先天防御系統的主要分子，也是肺組織抵御感染的一道防線[2]。又中醫學認為肺與外界相通為“嬌臟”，易為燥邪所傷，故本研究著眼于與外環境直接接觸的氣道黏膜以及肺內細小氣道黏膜組織，在實驗室營造秋燥之邪(以下簡稱輕度燥邪)和西北方域燥邪(以下簡稱重度燥邪)，比較二者對健康大鼠氣道和肺內細小支氣管黏膜組織形態學及SP-D表達的影響，探討燥邪犯肺或導致機體亞健康狀態的微觀機制，以期為研究西北燥證主證(又稱肺衛孔竅皮膚燥證)的證候機制尋找線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物分組與實驗干預：將60只SPF級SD雌鼠[動物生產許可證號SYXK(新)2011-0004,140～160 g,鼠]按體重隨機均分為六組，即正常對照組(N-24 d和N-48 d)置于常溫(21 ℃)常濕(相對濕度50%～55%)SPF級環境中；秋燥組(D-24 d和D-48 d)置于人工氣候箱中予輕度燥邪；西北燥組(D&D-24 d和D&D-48 d)在人工氣候箱和砂塵試驗箱內予重度燥邪；全部大鼠普食飼喂，干預24 d和48 d。

1.1.2 主要儀器：改造后的PRX-1250B型程控智能人工氣候箱(上海德洋意邦儀器有限公司)，DSC-1000型砂塵試驗箱(江蘇博科)。

1.1.3 主要試劑：博士德兔抗SP-D抗體(1∶50)。Abcom兔抗SP-D抗體(1∶2000)，3% H2O2(山東德新康)。兔二步法試劑盒、0.01 mol/L枸櫞酸鹽抗原修復液、羊血清封閉液、DAB顯色試劑盒、蘇木素染液、伊紅染液、0.01 mol/L PBS緩沖液均使用中杉金橋產品。

1.1.4 標本的采集與制備：干預結束后禁食不禁水16 h以上，之后用10%水合氯醛腹腔注射保定大鼠，腹主動脈采血后迅速摘取上氣道和右肺中葉組織，在4 ℃生理鹽水中洗3遍，用4%多聚甲醛固定組織，常規脫水、石蠟包埋，制備石蠟切片。

1.2 實驗方法

1.2.1 秋燥組(輕度燥邪)模擬：參考燥邪模擬方案[3]，人工氣候箱溫度的設定采用方案中Ⅰ類和Ⅲ類參數(6～24 ℃和10～30 ℃)、相對濕度為5%～45%，日均相對濕度(24.33±11.29)%，風速3 m/s，光照度 5～20 LX且日照總時數遞減，以此模擬輕度燥邪。

1.2.2 西北燥組(重度燥邪)模擬：參考燥邪模擬方案[3]，人工氣候箱溫度的設定采用方案中Ⅰ-Ⅳ類溫度參數，日溫差也隨Ⅰ-Ⅳ類溫度參數的不同分別進行設定；光照度設定為5～20 LX，但適時遞增和遞減日照總時數以模擬四季日照；同時使用砂塵試驗箱進行風沙干預，設定風速為6～8 m/s，粒徑小于10 μm浮塵吹塵20 min/次，浮塵量300 g/(m3·次)，兩次吹塵間隔10 min，干預強度1 h/d，以此模擬重度燥邪。

1.2.3 HE染色：石蠟切片，60 ℃溫箱烤片40 min，常規脫蠟,蘇木素染色2 min,自來水洗去多余染液,伊紅染色1 min,自來水洗去多余染液,后用1%鹽酸乙醇分化3 s,0.01 mol/L PBS反藍1 min,后依次放入80%乙醇、95%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ和無水乙醇、兩組透明液中各5 s,自然晾干后封片按1.1.4免疫組化染色,60 ℃溫箱烤片，常規脫蠟，0.01 mol/L PBS緩沖液清洗5 min,連續3次；浸入3% H2O2中10 min，之后入0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽溶液中煮10 min(92～98 ℃)，自然放涼，切片甩干，滴羊血清封閉液(80 μl/標本)，30 min后甩干并滴加一抗，其中肺組織使用兔抗SP-D抗體(Abcam,濃度1∶2000，80 μl/標本)，氣道使用兔抗SP-D抗體(博士德,濃度1∶50,40 μl/標本)；濕盒中4 ℃過夜，次日復溫1 h后甩干，入0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，滴加二抗(100 μl/標本)后室溫反應40 min，甩干后入0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次,DAB顯色。自來水洗后入蘇木素復染2 min，用自來水洗3遍，再入1%鹽酸乙醇中分化1 s，自來水反藍1 min，依次放入80%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、無水乙醇、兩組透明液中各5 s，晾干后用中性樹膠封片備用。

1.3 統計學方法 采用Image-Pro Plus 6.0 分析免疫組化圖像圖像并記錄積分光密度(IOD)，采用SPSS 23.0進行統計分析，兩組間比較采用t檢驗(方差齊時)或近似t檢驗(方差不齊時)；多組組間平均IOD值進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，當組間方差齊時，用最小顯著性差異法(LSD)，當組間方差不齊時用多元Tamhane’s T2。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 燥邪對健康大鼠氣道組織形態學的影響 鏡下N-24 d組和N-48 d組大鼠氣管結構完整，假復層纖毛柱狀上皮細胞排列有序，未見黏膜腫脹、充血、增生、斷裂脫落及炎性改變。D-24 d組假復層纖毛柱狀上皮部分脫落、分布稀疏，出現局灶性增生、充血和炎性浸潤。相較于D-24 d組，D-48 d組大鼠氣管增生、充血明顯伴多發炎性病灶，并見黏膜斷裂缺失，假復層纖毛柱狀上皮細胞排列紊亂。D&D-24 d組黏膜顯著增生、充血腫脹明顯，黏膜及黏膜下層大面積炎性浸潤，黏膜表層見塵土顆粒。D&D-48 d組氣管，假復層纖毛柱狀上皮損傷有所修復，細胞增殖，上皮層加厚，呈指狀突出樣改變，黏膜層結構不完整，纖毛量有所恢復。氣管腺處依舊可見炎性細胞。提示重度燥邪干預下，隨著干預時間的延長，氣道組織形態學損傷有所修復(圖1)。

圖1 各組SD大鼠氣管組織形態學改變(HE染色，×200)

2.2 燥邪對健康大鼠氣道黏膜SP-D的表達 各組大鼠氣道黏膜組織SP-D表達的IOD均值見表1。氣道黏膜SP-D表達量在N-24 d組和N-48 d組組間、在N-24 d組、D-24 d組和D&D-24 d組組間所顯現的差異均無統計學意義。但N-48 d組、D-48 d組和D&D-48 d組大鼠氣道黏膜SP-D表達的組間兩兩比較結果顯示，D-48 d組氣道黏膜SP-D表達量分別高于N-48 d組(P<0.05)和D&D-48 d組(P<0.05)。而對N-24 d組、D-24 d組和D-48 d組氣道黏膜SP-D表達進行組間兩兩比較，結果亦顯示D-48 d組氣道黏膜SP-D表達量分別高于N-24 d組(P<0.05)和D-24 d組(P<0.05)。但N-48 d組、D&D-24 d組和D&D-48 d組大鼠氣道黏膜SP-D表達的組間兩兩比較結果顯示，上述三組組間差異均無統計學意義。提示長期處于輕度燥邪干預下大鼠氣道黏膜SP-D表達出現升高的現象，但重度燥邪干預下大鼠氣道黏膜SP-D的表達卻未出現上述現象(圖2)。

表1 輕度燥邪和重度燥邪干預下健康大鼠氣道黏膜SP-D表達

圖2 各組SD大鼠氣道黏膜SP-D表達(免疫組化染色，×200)

2.3 燥邪對健康大鼠肺內細小支氣管SP-D的表達 表2所示為各組大鼠肺內細小支氣管黏膜組織SP-D表達的IOD均值。肺內細小支氣管黏膜SP-D表達在N-24 d組和N-48 d組組間、N-24 d組、D-24 d組和D&D-24組三組之間、N-48 d組、D-48 d組和D&D-48 d組組間、N-24 d組、D-24 d組、D-48 d組三組組間、在N-48 d組、D&D-24 d組和D&D-48 d組三組組間的差異均無統計學意義。

表2 輕度燥邪和重度燥邪干預下健康大鼠肺內小支氣管SP-D的表達

3 討 論

PS是由脂質和疏水性表面活性物質相關蛋白組成的復合物[3]，主要由Ⅱ型肺泡上皮細胞產生。PS分布于肺泡內且具有降低氣液界面表面張力、維持氣道穩定性及氣道內液體平衡的作用[4-5]。PS是肺和氣道固有免疫功能的重要組成部分，肺泡表面PS可形成防止吸入性物質擴散的屏障，保護氣道免受外來藥物、變應原的刺激，還可通過改善顆粒和細菌從外周氣道向中央氣道的運輸來提高支氣管的清除率[6-9]。 SP-D是膠原凝集素家族的親水性大分子糖蛋白，主要由肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌，占PS總重量的1%，屬于模式識別分子(Pattern recognition molecules,PRMS)[2]。SP-D不僅在肺和氣道表達，更可廣泛表達在體內其他組織的上皮表面，SP-D同時具有固有免疫蛋白的全部特性，它不僅可以調節肺泡表面張力，穩定肺泡內壓，增加肺的順應性，減少肺組織液生成而防止肺水腫，亦可通過與黏膜束內的上皮細胞及適應性免疫細胞、先天免疫細胞的受體相互作用以發揮其免疫調節功能，并結合細菌和真菌，募集病毒，促進巨噬細胞的吞噬功能，在宿主防御和炎癥調節過程中起關鍵作用，是呼吸系統疾病病理機制和藥理機制研究的常用研究指標[10-14]。

本研究結果顯示，燥邪可引起氣道組織形態學的異常改變。輕度燥邪干預下，大鼠氣道假復層纖毛柱狀上皮部分脫落、局灶性增生、充血和炎性浸潤，損傷程度隨干預時長增加加重。此現象可能與燥邪性質相關，中醫學認為，燥邪致病多有干燥收斂，清肅之特性，屬陰中之陽，多為秋季燥熱之氣轉化而成。其性干澀，易傷津耗液，最易傷肺，當氣道受燥邪侵犯，氣道內津液損耗，失于濡養從而更易引發并加重氣道炎癥反應。與氣道組織形態學改變相同，氣道黏膜SP-D表達隨著干預時間的延長亦出現增高的趨勢，此與云南春燥環境可使小鼠氣道內SP-D含量上升的研究結果相一致[15-18]。依據血清SP-D水平升高可以作為氣道炎癥的生物標志物，尤指慢性氣道炎癥的生物標志物[19]；急性肺損傷時肺組織SP-D升高考慮為保護性因素等研究結果[20-21]。本研究推斷當機體感受秋燥之邪進行免疫自主調節，通過上調氣道黏膜SP-D表達以促進巨噬細胞的分泌來吞噬病原體，調節機體炎癥反應以增強對秋燥之邪的抵抗力。與輕度燥邪相比，重度燥邪干預下大鼠氣道增生、充血明顯，可見大面積炎性浸潤，黏膜表層可見塵土顆粒，干預后期有所修復。但氣道黏膜SP-D表達未發生明顯改變，兩種不同程度燥邪干預下出現的差異，提示秋燥之邪和西北方域燥邪不同干預條件下氣道黏膜的固有免疫機制可能有所區別。與氣道黏膜SP-D表達的變化不同，肺內細小氣道黏膜SP-D表達在各組組間的差異無統計學意義，說明燥邪對健康機體肺內細小氣道黏膜SP-D表達未造成直接影響。此外，本研究中西北方域燥邪干預下大鼠氣道損傷狀況于后期有所修復，但此現象與氣道黏膜SP-D表達不相關，可推測該現象或與其他蛋白通路相關，但其具體的病理機制還有待進一步的研究探索。本研究據此推斷，氣道黏膜SP-D異常表達可能是燥邪致病亞健康狀態的微觀機制之一，或可用于闡釋“肺為嬌臟”和“燥易犯肺”之中醫學理論；而秋燥之邪和西北方域燥邪對氣道黏膜SP-D表達影響的差異性則提示，氣道黏膜SP-D表達可作為西北燥證證候機制研究的線索之一。